异甘草素联合替莫唑胺对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖的影响

异甘草素联合替莫唑胺对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖的影
响
孙红军;林瑜亮;党莹;马占峰;铁兴华;屈晓东;荔志云
【摘要】目的探讨异甘草素联合替莫唑胺对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖的影响.方法采用含无血清达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM/F12)(含表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、B27)的悬浮细胞培养板培养、纯化胶质瘤干细胞,并通过CD133联合Nestin标记进行免疫荧光鉴定;实验分为对照组[含二甲基亚砜(DMSO)]、异甘草素(5～160 μmol/L)组、替莫唑胺(12.5～200 μmol/L)组、异甘草素+替莫唑胺组(160 μmol/L+ 12.5～200 μmol/L),通过细胞增殖-毒性检测(CCK-8)法、流式细胞术、免疫荧光染色法分别检测细胞抑制率、细胞周期及干细胞表面相关分化蛋白表达情况.结果异甘草素随着浓度增加细胞抑制作用越强,且160 μmol/L时抑制率达32％,替莫唑胺随着浓度增加抑制作用越强,且
200μmol/L时抑制率达40％;异甘草素联合替莫唑胺组随着浓度增加抑制作用越强,且160 μmol/L +200 μmol/L时抑制率达72％;随着异甘草素浓度增加G0/G1期细胞比例增加,细胞周期阻滞于G0/G1期;随着异甘草素浓度增加干细胞分化越多,且分化细胞的死亡越多.结论异甘草素能诱导SHG44人脑胶质瘤干细胞向星形胶质细胞和神经元细胞分化,且能抑制增殖,同时增强替莫唑胺化疗敏感性.
【期刊名称】《中华神经外科疾病研究杂志》
【年(卷),期】2016(015)005
【总页数】5页(P405-409)
【关键词】异甘草素;替莫唑胺;SHG44人脑胶质瘤干细胞;诱导分化;抑制增殖;化疗敏感性
【作者】孙红军;林瑜亮;党莹;马占峰;铁兴华;屈晓东;荔志云
【作者单位】兰州军区兰州总医院神经外科,甘肃兰州730050;兰州军区兰州总医
院神经外科,甘肃兰州730050;兰州军区兰州总医院神经外科,甘肃兰州730050;兰
州军区兰州总医院神经外科,甘肃兰州730050;兰州军区兰州总医院神经外科,甘肃
兰州730050;兰州军区兰州总医院神经外科,甘肃兰州730050;兰州军区兰州总医
院神经外科,甘肃兰州730050
【正文语种】中文
【中图分类】R739
胶质瘤是最常见的神经上皮源性颅内肿瘤，约占中枢神经系统肿瘤的40%，占中
枢神经系统恶性肿瘤的81%[1]。

目前手术、化疗、放疗等治疗效果均不佳，其主要原因是胶质瘤细胞耐放化疗。

2003年Singh等[2]采用无血清神经干细胞培养
基分离出了脑肿瘤干细胞，2004年李铭初等[3]也相继成功分离出了脑肿瘤干细胞，这些发现为胶质瘤的治疗指明了方向。

胶质瘤干细胞是脑胶质瘤组织的起源细胞，是肿瘤转移复发的源泉，是肿瘤各种治疗包括化学药物治疗的靶标，理论上，只有有效杀灭脑胶质瘤干细胞，才能达到治愈肿瘤的目的。

传统化疗仅针对脑肿瘤细胞，而对于脑胶质瘤干细胞的作用及机制的研究较少。

异甘草素(isoliquiritigenin, ISL)是一种异黄酮类化合物，主要存在于甘草中，具有抗肿瘤、抗病毒、抗自由基、松弛血管、抑制血小板聚集、抑制脂质过氧化等生物活性[4]。

近年来，研究发现ISL 具有促进肿瘤细胞分化，并抑制其生长的特点。

替莫唑胺(temozolomide,TMZ)
抗胶质瘤的临床应用已公认。

本实验以SHG44人脑胶质瘤干细胞为研究对象，研
究通过ISL联合TMZ对胶质瘤干细胞增殖的影响，进一步为ISL抑制胶质瘤干细
胞提供实验依据。

一、实验材料与试剂
人脑胶质瘤SHG44细胞系(ATCC公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；胎牛血清
( Hyclone公司)；达尔伯克氏必需基本培养基(Dulbecco's Modified Eagle Media, DMEM)培养基( Gibco公司)；达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle Media: Nutrient Mixture F-12,
DMEM/F12)(1 ∶1)(Gibco公司)；重组人表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、B27、重组人碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)(Invitrogen公司)；小鼠抗人Nestin抗体(Abcam公司)；兔抗人CD133
抗体(Abnova公司)；异硫氰酸荧光素(fluoresceine isothiocyanate, FITC)标记的山羊抗兔二抗(Abcam公司)；藻红蛋白 (phyloerythrin, PE)标记的兔抗小鼠二抗(Abcam公司)；免疫染色封闭液、抗荧光淬灭封片液(碧云天生物科技研究所)；悬浮细胞培养板6孔和96孔(Cyagen公司)；碘化丙啶(propidine iodide, PI)和细
胞增殖-毒性检测(cell counting Kit-8, CCK-8)试剂盒(Sigma-Aldrich公司)；异
甘草素(上海源叶生物科技有限公司)。

二、细胞培养
1.SHG44人脑胶质瘤细胞培养：人脑胶质瘤SHG44细胞以105个/ml接种于含10%胎牛血清高糖型DMEM培养基中。

于37℃、5%CO2、100%湿度培养箱中
培养，每2～3 d换液一次。

待细胞长满培养皿底约80%时传代。

2.SHG44人脑胶质瘤干细胞培养及鉴定：将培养在含10%胎牛血清DMEM培养
基中的对数生长期的SHG44胶质瘤细胞，弃去培养液，0.25%胰蛋白酶2 ml置
于100 mm培养皿中消化约1 min，用无血清神经干细胞培养基DMEM/F12(内
含2% B27、EGF 20 μg/L、bFGF 20 μg/L)终止消化，将其移至15 ml离心管中，
反复吹打成单细胞悬液。

1 500 rpm 离心8 min。

弃去上清液，加入5 ml无血清神经干细胞培养液洗涤沉淀，1 500 rpm 离心5 min。

弃去上清液，无血清神经干细胞培养液再次悬浮沉淀，形成1×104个细胞/ml 的悬浮细胞液。

取其1 ml 接种于悬浮细胞六孔板，加入1 ml无血清培养基，每天添加400 μl培养基。

待胶质瘤干细胞生长至7 d后再次收集离心，消化吹打悬浮成单个细胞后，再次接种于悬浮细胞六孔板。

经3次纯化培养后进行实验。

取良好活力的胶质瘤干细胞球，接种于经多聚赖氨酸包被的玻片上，37℃晾干，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)漂洗3×5 min，室温4%多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛，PBS漂洗3×5 min，0.5% TritonX-100 37℃透膜10 min；加免疫染色封闭液，室温孵育30 min；滴加稀释好的一抗：CD133 (1 ∶200)，Nestin
(1 ∶200)，放入湿盒4℃孵育过夜。

弃去一抗孵育液，PBS漂洗3×5 min，加
1 ∶100稀释的PE标记的兔抗小鼠二抗及1 ∶1 000稀释的FITC标记的山羊抗兔二抗，37℃孵育40min；PBS漂洗3×5 min；4',6 二脒基-2-苯吲哚盐酸( 4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) 封片，荧光显微镜下观察并拍照。

三、CCK-8法检测细胞增殖和细胞抑制
调整细胞密度至2.5×103个/孔(100 μl)接种到96孔悬浮细胞培养板中并进行预培养。

对照组和ISL每个浓度均设6个复孔。

37℃、5%CO2、100%湿度培养24 h，每孔加入CCK-8液8 μl，继续孵育3 h后使用酶标仪读取450 nm处吸光度值。

重复3次。

四、细胞周期测定
经ISL(0 μmol/L、10 μmol/L、40 μmol/L、160 μmol/L)加药作用72 h后，收集细胞至10 ml离心管，1 000 r/min 离心5 min，弃上清液；用0.01 mol/L PBS清洗细胞3次，P BS 500 μl重悬细胞后转移至1.5 ml离心管，1 ml 70%冰乙醇4℃固定过夜。

1 200 r/min离心5 min，0.01 mol/L PBS 1 ml重悬，50
mg/ml RNase A 37℃作用1 h；用50 μg/ml碘化丙啶避光染色30 min，200
目细胞筛过滤后进行流式细胞仪上样检测。

实验重复3次。

五、免疫荧光染色标记胶质瘤干细胞分化情况
取纯化、培养活力良好的胶质瘤干细胞400 μl(150个细胞/400 μl)接种于放置有
多聚赖氨酸包被的玻片的悬浮细胞24孔板，并加ISL至终浓度(10～160 μmol/L)，至72 h。

PBS 漂洗3×5 min，室温4%多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛，PBS漂洗3×5 min，0.5%TritonX-100 37℃透膜10 min；加免疫染色封闭液，
室温孵育30 min；滴加稀释好的一抗：Nestin ( 1 ∶200)，β-Tubulin Ⅲ(1 ∶1 000)，GFAP(1 ∶50)，放入湿盒4℃孵育过夜。

弃去一抗孵育液，PBS漂洗3×5 min，加1 ∶100稀释的PE标记的兔抗小鼠二抗，37℃孵育40 min；PBS漂洗
3×5 min；4',6二脒基-2-苯吲哚盐酸(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) 封片，荧光显微镜下观察并拍照。

六、统计学分析
数据均以均值±标准差表示，使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析。

一、胶质瘤干细胞镜下形态及鉴定
1.胶质瘤干细胞倒置显微镜形态：SHG44胶质瘤干细胞经Cyagen 6孔悬浮细胞
培养板3次纯化、培养至第7天，通过倒置显微镜观察，胶质瘤干细胞呈大小不
等悬浮克隆球样生长(图1B)，而胶质瘤细胞呈贴壁样生长，且胞体伸出较长突起(图1A)。

2.胶质瘤干细胞鉴定：荧光染色后，荧光显微镜下观察胶质瘤干细胞球的干细胞标记物Nestin、CD133表达呈阳性(图2)，其中绿色是FITC标记，红色是PE标记，DAPI染核呈蓝色。

二、ISL联合替莫唑胺对SHG44人脑胶质瘤干细胞抑制的影响
ISL随着浓度增加细胞抑制作用越强，且160 μmol/L时抑制率达32%(图3A)，
替莫唑胺随着浓度增加抑制作用越强，且200 μmol/L时抑制率达40%(图3B)；ISL联合替莫唑胺组随着浓度增加抑制作用越强，且160 μmol/L+200 μmol/L时抑制率达72%(图3C)。

三、不同浓度ISL对胶质瘤干细胞细胞周期的影响
ISL作用72 h时，10 μmol/L组与对照组相比，G2/M期细胞比例由0%增加至11.50%±8.29%(Plt;0.05)，当浓度增加至40 μmol/L及160 μmol/L，G2/M期
细胞比例下降至0%；与对照组相比，G0/G1期细胞比例由26.89%±8.09%增加至：10 μmol/L组48.24%±24.68%，40 μmol/L组56.56%±14.51%，160
μmol/L组83.52%±9.85%(图4)。

四、ISL诱导胶质瘤干细胞分化情况
各浓度组随机选取5个视野拍照发现(图5)，对照组胶质瘤干细胞无明显分化，且呈球形，72 h后，随着浓度增加分化细胞及干细胞同时减少，且高浓度时分化细
胞较小且突起较短。

其中未分化胶质瘤干细胞呈悬浮球样(图5A)；分化的神经元
细胞发出长突起，呈纤维网状(图5B)；分化的星形胶质细胞胞体发出许多长而分
支的突起，且突起的末端膨大形成脚板(图5C)。

胶质瘤干细胞是胶质瘤细胞克隆源性细胞[6]，是胶质瘤耐化疗、抗拒放疗以及胶
质瘤进展和复发的根源[7]。

胶质瘤干细胞可分化为神经元、星形胶质细胞、少突
胶质细胞以及小胶质细胞。

CD133是胶质瘤干细胞最重要的标记物，Nestin是神经干细胞的标志物，目前也被广泛作为胶质瘤干细胞标志物应用。

另外，小部分CD133阴性细胞也具有胶质瘤干细胞特性，但CD133阳性筛选是目前唯一可靠
的评估方法[8]。

本研究通过CD133联合Nestin进行免疫荧光鉴定，呈阳性表达，证实此类神经球具有胶质瘤干细胞的特性。

ISL是甘草黄酮类化合物中主要的药用活性成分之一，具有广谱抗肿瘤、抗氧化、解痉、抗心律失常等作用[9]，近年来，国内外学者对此已进行了大量的研究。

其
中ISL抗肿瘤机制是目前研究的热点之一。

前期实验研究发现ISL具有抑制SHG44胶质瘤细胞增殖的作用，且呈时间和剂量依赖性，经ISL处理的SHG44胶质瘤细胞，其细胞内自噬体和自噬溶酶体明显增加，自噬相关分子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著增加，且ISL可通过抑制抗凋亡分子 Bcl-2和增加凋亡相关分子 Caspase-3促发SHG44胶质瘤细胞凋亡，从而抑制和杀伤胶质瘤细胞。

景治涛等[10]研究发现TMZ可通过下调TGF-β2 的表达来抑制胶质瘤干细胞和分化胶质瘤细胞的侵袭，并降低他们的免疫抑制作用。

本研究发现ISL和TMZ分别作用72 h时对胶质瘤干细胞抑制作用呈剂量依赖性，而且ISL联合TMZ可明显增强抑制作用。

同时研究发现ISL能诱导胶质瘤干细胞向星形胶质细胞和神经元分化，且随浓度增加诱导作用增强。

TMZ联合ISL抑制作用明显强于ISL或TMZ单药的抑制作用，可能是由于ISL诱导胶质瘤干细胞进入分化状态并增强了TMZ的化疗敏感性。

李雅娟等[11]研究发现ISL能抑制大鼠 C6 胶质瘤细胞的增殖，并能诱导C6细胞向星形胶质细胞分化，且呈时间、剂量依赖性，可能是通过调控细胞内氧化还原状态诱导C6胶质瘤分化，但具体机制尚不清楚。

本研究发现，不同浓度ISL作用于SHG44胶质瘤干细胞时，与对照组相比，ISL 组G0/G1期细胞比例显著增加，且随着浓度增加G0/G1细胞比例也随着增加，说明ISL能使细胞发生G0/G1阻滞。

综上所述，本研究证明ISL能抑制胶质瘤干细胞增殖，且能改变其细胞周期，可明显增强TMZ化疗敏感性。

因此，继续深入研究ISL对胶质瘤干细胞的作用机制，ISL可能是更具选择性、有效性以及低毒的新型抗胶质瘤干细胞药物，与目前的治疗方式相结合，可能将大大改善胶质瘤患者的预后和延长其寿命。

【相关文献】
1Chen J, McKay RM, Parada LF. Malignant glioma: lessons from genomics, mouse models, and stem cells [J]. Cell, 2012, 149(1): 36-47.
2Singh SK, Clarke ID, Terasak IM, et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors [J]. Cancer Res, 2003, 63(18): 5821-5828.
3李茗初. 脑肿瘤干细胞的分离培养、鉴定与移植致瘤实验研究 [D]. 长沙: 中南大学, 2005: 1-112. 4Li D, Wang Z, Chen H, et al. Isoliquiritigenin induces monocytic differentiation of HL-60 cells [J]. Free Radic Biol Med, 2009, 46(6): 731-736.
5Ye L, Gho WM, Chan FL, et al. Dietary administration of the licorice flavonoid isoliquiritigenin deters the growth of MCF-7 cells overexpressing aromatase [J]. Int J Cancer, 2009, 124(5): 1028-1036.
6Cruceru ML, Neagu M, Demoulin JB, et al. Therapy targets in glioblastoma and cancer stem cells: lessons from haematopoietic neoplasms [J]. J Cell Mol Med, 2013, 17(10): 1218-1235.
7Schonberg DL, Lubelski D, Miller TE, et al. Brain tumor stem cells: Molecular characteristics and their impact on therapy [J]. Mol Aspects Med, 2014, 39(5): 82-101.
8Venere M, Fine HA, Dirks PB, et al. Cancer stem cells in gliomas: identifying and understanding the apex cell in cancer's hierarchy [J]. Glia, 2011, 59(8): 1148-1154.
9陈日来, 李玉珍, 李成. 异甘草素的研究进展 [J]. 临床医药实践, 2008, 1(13): 462-466.
10景治涛, 张东勇, 吴安华, 等. 替莫唑胺通过TGF-β2影响胶质瘤干细胞的侵袭性研究 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2014, 13(1): 13-17.
11李雅娟, 甘露, 王占洋, 等. 异甘草素对大鼠C6胶质瘤细胞增殖和分化的影响 [J]. 中国药理学通报, 2015, 31(9): 1298-1303.。