蛋白质体外表达技术蛋白质相互作用研究方法
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目的蛋白是否可溶？ 诱导物浓度、温度、标签
28
小量诱导 IPTG：0.1-1mM 温度: 18-37℃ 上清、包涵体 Western鉴定
29
大量诱导 蛋白纯化
亲和纯化：商品化的填料 his标签 、 GST标签等
30
原核表达蛋白的用途
体外研究： 蛋白质的活性分析
蛋白质之间的相互作用 制备抗原：
17
step-2 表达载体
➢融合标签（fusion tag）
HIS、FLAG、HA、Myc、GST、MBP
➢ 标签是否去除 ➢ 限制性内切酶位点
18
HIS、FLAG、HA、Myc、GST、MBP
融合标签的作用
检测和纯化目的蛋白 增加目的蛋白的可溶性 有助于目的蛋白的定位，提高其生物活性
19
制备抗体 结晶：用于蛋白质结构的研究
31
蛋白质相互作用研究方法
32
蛋白质之间的相互作用
酵母双杂交 COIP（CO-ImmunoPrecipitation） Pull down
33
酵母双杂交
34
ImmunoPrecipitation
35
ImmunoPrecipitation
36
37
CoIP（Co-ImmunoPrecipitation）
38
原核表达蛋白
HIS FLAG HA Myc GST MBP
39
Pull down
40
Pull down
41
Pull down
42
43
原核表达
15
step-1 基因克隆 step-2 表达载体
step-3
细胞
step-4 表达条件
16
step-1 基因克隆
RT-PCR
➢ 开放阅读框、起始、终止
ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TTC ACT…….. M S K G E E F L T ……..
ACA CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TAA T H GM DE L Y K -
synthesis
12
in vivo protein expression
原核生物： 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌
真核生物： 酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞
13
大肠杆菌： 增殖快、结构简单、易于操作
枯草芽孢杆菌： 分泌系统，载体少、表达量低
酵母： 表达量低
昆虫细胞： 外源蛋白产生时期短
14
protein expression in E. Coli.
cell free
优点
快速 避免蛋白酶作用 氨基酸可控制
chemical synthesis
氨基酸可控制 纯度高
缺点
产量低
费用高 只适合短肽
产量低 活性难以保证
11
in vivo protein expression
in vitro（cell-free） protein expression chemical protein
22
pET系统的启动子-T7/lac I
23
step-3 菌株
菌株：
BL21(DE3) Rosetta
可增强带有大肠杆菌稀有密码子 的真核蛋白的表达
24
25
ห้องสมุดไป่ตู้
密码子的偏好性 同义密码子的使用频率？
Lys
Glu
26
Rosetta
“万能” 翻译菌株
27
step-4 表达条件
目的蛋白能否表达？ 诱导条件、载体、标签、菌株
蛋白质体外表达技术 蛋白质相互作用研究方法
李媛 2012.11.30
生物学研究---基因功能
4
正向遗传学
loss-of-function gain-of-function
表型
基因
反向遗传学
基因
loss-of-function gain-of-function
表型
5
蛋白质的表达
基因功能
蛋白功能？
原核生物、真核生物 酶、辅助因子等 合成多肽链
8
in vivo protein expression
9
原核 真核
优点
菌体生长快 产量高
应用广泛
可修饰、折叠
缺点
无法修饰 无法折叠 易形成包涵体 不能表达毒性蛋白
产量低 费时
不能表达毒性蛋白
10
cell-free protein expression chemical protein synthesis
pET载体系列
Novagen公司
功能最强大、应用最广泛 pET3, pET5, pET9， pET28，
pET30， pET34……..等35种载体
20
pET载体系列的特点
基础表达水平最低 提供各种不同融合标签 二硫键形成、蛋白外运等专用载体
pET载体 原核蛋白表达引用最多的系统
21
0.25mM IPTG, 28 ℃诱导
6
基因
蛋白
功能
遗传信息
多样
结构
单一
复杂、修饰多
获取
容易
较难
技
术
较成熟、稳定 种类多、较复杂
操作简单
易变性
研究内容
简单
具体分析
7
蛋白功能？
蛋白质体外表达技术
in vivo protein expression
in vitro（cell-free） protein expression
chemical protein synthesis
28
小量诱导 IPTG：0.1-1mM 温度: 18-37℃ 上清、包涵体 Western鉴定
29
大量诱导 蛋白纯化
亲和纯化：商品化的填料 his标签 、 GST标签等
30
原核表达蛋白的用途
体外研究： 蛋白质的活性分析
蛋白质之间的相互作用 制备抗原：
17
step-2 表达载体
➢融合标签（fusion tag）
HIS、FLAG、HA、Myc、GST、MBP
➢ 标签是否去除 ➢ 限制性内切酶位点
18
HIS、FLAG、HA、Myc、GST、MBP
融合标签的作用
检测和纯化目的蛋白 增加目的蛋白的可溶性 有助于目的蛋白的定位，提高其生物活性
19
制备抗体 结晶：用于蛋白质结构的研究
31
蛋白质相互作用研究方法
32
蛋白质之间的相互作用
酵母双杂交 COIP（CO-ImmunoPrecipitation） Pull down
33
酵母双杂交
34
ImmunoPrecipitation
35
ImmunoPrecipitation
36
37
CoIP（Co-ImmunoPrecipitation）
38
原核表达蛋白
HIS FLAG HA Myc GST MBP
39
Pull down
40
Pull down
41
Pull down
42
43
原核表达
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step-1 基因克隆 step-2 表达载体
step-3
细胞
step-4 表达条件
16
step-1 基因克隆
RT-PCR
➢ 开放阅读框、起始、终止
ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TTC ACT…….. M S K G E E F L T ……..
ACA CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TAA T H GM DE L Y K -
synthesis
12
in vivo protein expression
原核生物： 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌
真核生物： 酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞
13
大肠杆菌： 增殖快、结构简单、易于操作
枯草芽孢杆菌： 分泌系统，载体少、表达量低
酵母： 表达量低
昆虫细胞： 外源蛋白产生时期短
14
protein expression in E. Coli.
cell free
优点
快速 避免蛋白酶作用 氨基酸可控制
chemical synthesis
氨基酸可控制 纯度高
缺点
产量低
费用高 只适合短肽
产量低 活性难以保证
11
in vivo protein expression
in vitro（cell-free） protein expression chemical protein
22
pET系统的启动子-T7/lac I
23
step-3 菌株
菌株：
BL21(DE3) Rosetta
可增强带有大肠杆菌稀有密码子 的真核蛋白的表达
24
25
ห้องสมุดไป่ตู้
密码子的偏好性 同义密码子的使用频率？
Lys
Glu
26
Rosetta
“万能” 翻译菌株
27
step-4 表达条件
目的蛋白能否表达？ 诱导条件、载体、标签、菌株
蛋白质体外表达技术 蛋白质相互作用研究方法
李媛 2012.11.30
生物学研究---基因功能
4
正向遗传学
loss-of-function gain-of-function
表型
基因
反向遗传学
基因
loss-of-function gain-of-function
表型
5
蛋白质的表达
基因功能
蛋白功能？
原核生物、真核生物 酶、辅助因子等 合成多肽链
8
in vivo protein expression
9
原核 真核
优点
菌体生长快 产量高
应用广泛
可修饰、折叠
缺点
无法修饰 无法折叠 易形成包涵体 不能表达毒性蛋白
产量低 费时
不能表达毒性蛋白
10
cell-free protein expression chemical protein synthesis
pET载体系列
Novagen公司
功能最强大、应用最广泛 pET3, pET5, pET9， pET28，
pET30， pET34……..等35种载体
20
pET载体系列的特点
基础表达水平最低 提供各种不同融合标签 二硫键形成、蛋白外运等专用载体
pET载体 原核蛋白表达引用最多的系统
21
0.25mM IPTG, 28 ℃诱导
6
基因
蛋白
功能
遗传信息
多样
结构
单一
复杂、修饰多
获取
容易
较难
技
术
较成熟、稳定 种类多、较复杂
操作简单
易变性
研究内容
简单
具体分析
7
蛋白功能？
蛋白质体外表达技术
in vivo protein expression
in vitro（cell-free） protein expression
chemical protein synthesis