天香丹减轻大鼠冠脉微血栓及调节Nrf2ARE信号通路的机制

ʌ实验研究ɔ
天香丹减轻大鼠冠脉微血栓及调节Nrf2/ARE
信号通路的机制
❋
马学宽1,古丽葛娜㊃萨吾尔1,张㊀华1,辛锦钰1,王思静1,安冬青1,2ә
(1.新疆医科大学中医学院,乌鲁木齐㊀830011;2.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室,
乌鲁木齐㊀830011)
❋基金项目:国家自然科学基金资助项目(8176150028)-基于 太阳系学说 探讨天香丹调控Nrf2/ARE 信号通路改善冠心病冠脉微循环障碍的机制研究
作者简介:马学宽(1995-),男,新疆伊犁人,在读硕士生,从事心血管疾病的临床与研究㊂
ә通讯作者:安冬青(1962-),女,新疆乌鲁木齐人,教授,博士研究生,博士研究生导师,从事中药临床与基础研究,Tel :180****8099,E-mail :andongqing3@ ㊂
㊀㊀摘要:目的:通过观察天香丹对冠脉微循环障碍大鼠微血栓的改善情况及Nrf2/ARE 信号通路的调控作用,探讨其改善冠脉微循环障碍的机制㊂方法:36只雄性SPF 级SD 大鼠随机分为空白对照组㊁模型组㊁尼可地尔组㊁天香丹组各9只,大鼠开胸经左心室注射月桂酸钠建立冠脉微循环障碍大鼠模型,空白对照组不进行处理,术后分别给予天香丹㊁尼可地尔及生理盐水灌胃,给药28d 后检测超声心动图,HE 染色(Hematoxylin-eosin staining )与马休黄-酸性品红-苯胺蓝染色观察冠脉微血管的形态学变化,透射电镜观察心肌细胞超微结构变化,免疫组化检测心肌中Nrf2㊁Keap1㊁NQO1的表达㊂结果:HE 及马休黄-酸性品红-苯胺蓝染色后,空白对照组未见微血栓;模型组大鼠冠脉微血管内弥漫分布着红色血栓混合物,并可见局部心肌纤维化;尼可地尔组及天香丹组大鼠心功能较模型组好转,2组微血管内血栓均不同程度减轻,电镜显示,模型组较空白对照组损伤明显,线粒体絮状改变,尼可地尔组及天香丹组线粒体损伤减轻,免疫组化显示与模型组比较天香丹组及尼可地尔组Keap1表达降低,与其他3组比较天香丹组Nrf2㊁NQO1表达升高㊂结论:天香丹可能通过激活Nrf2/ARE 信号通路,减轻冠脉微血管血栓程度,从而达到改善冠脉微循环障碍的作用㊂
㊀㊀关键词:冠脉微循环障碍;天香丹;Nrf2/ARE 信号通路
㊀㊀中图分类号:R285.5㊀㊀文献标识码:B㊀㊀文章编号:1006-3250(2021)04-0573-06
Mechanism of Tianxiang piu Reduces The Level of Coronary Microthrombus Dysfunction and Regulates The Expression of Nrf2/ARE Signal Pathway in Rats
MA Xue-kuan 1,GULIGENA Sa-wu-er 1,ZHANG Hua 1,XIN Jin-yu 1,WANG Si-jing 1,AN Dong-qing 1,2ә
(1.College of Traditional Chinese Medicine,XinJiang Medical University,Urumuqi 830011,China;2.Xinjiang Key Laboratory of Famous Prescription and Science of Formulas,Urumuqi 830011,China)
㊀㊀Abstract :Objective :In order to alleviate the effects of coronary microcirculation dysfunction in rats ,this article would explore if Tianxiang piu could control the Nrf2/ARE signal pathway to achieve the reduction of the coronary microcirculation dysfunction which has shown a disturbing effect in the rats level of microthrombosis.Method :36male SPF grade SD rats were randomly selected and divided into control group ,model group ,Nicorandil group and Tianxiang piu group ,each group were consisted of 9rats.Sodium laurate was injected to the ventriculus sinister after a thoracotomy on the rat from a model group of rats with coronary microcirculation dysfunction.The same way was adopted to establish animal models for Nicorandil group and Tianxiang piu group ,no intervention was given to the control group.After the thoracotomy ,Tianxiangdan ,Tianxiang piu and normal saline was administered separately to the corresponding rats stomach.Cardiac function changes were monitored after 28days of administering the medication using an echocardiograph.HE stanning and Improved Lendrum staining were used to monitor the morphological changes of the coronary micro-vessels ,transmission electron microscope was used to monitor changes of the ultra-microstructures in the myocardia cells.Immunohistochemical method was used to detect the expression of Nrf2㊁Keap1㊁NQO1in the myocardium.Results :After HE stanning and Improved Lendrum staining ,microthrombus was not found in the micro-vessels in the control group.A mixture of red blood thrombus was found in the coronary micro-vessels of the rats model group with diffused distribution ,and myocardial fibrosis could also be seen in some areas.The cardiac function of both the Nicorandil group and Tianxiang piu group were slightly better than the model group and the severity of the thrombus in the micro-vessels in these two rats groups reduced in various degree.The results of the electrons microscopy showed that the myocardial cells have obvious damaged in the model group rats compared to the control group ,the structure of mitochondria was changed into the cotton liked structures ,reduction of damage in the mitochondria was found in both the Nicorandil group and Tianxiang piu group.According to the immunohistochemistry ,there was a reduction of Keap1expression in both the Nicorandil group and Tianxiang piu group
compared to the model group;an elevation of Nrf2㊁NQO1expression was found in the Tianxiangdan group compare to the other three groups.Conclusion:Tianxiangdan could reduce the effects of coronary microcirculation dysfunction in rats, which might be something to do with the activation of Nrfe/ARE signal pathway
㊀㊀Key words:Coronary microcirculation dysfunction;Tianxiangdan;Nrf2/ARE signaling pathway
㊀㊀冠脉微循环障碍(coronary microcirculation dysfunction,CMD)是急性冠状动脉综合征及经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)围术期常见并发症㊂研究显示,CMD与冠脉无复流或慢血流存在关联且与患者预后密切相关,在心血管疾病的发生发展及转归中起着重要作用[1]㊂天香丹为临床运用30余年的名老中医经验方,前期研究表明能够抗自由基损伤,改善缺血再灌注后微循环障碍,减轻心肌缺血[2]㊂本研究向左心室内注射月桂酸钠制作大鼠冠脉微循环障碍动物模型,评估天香丹对大鼠冠脉微血栓的影响,检测核转录因子NF-E2相关因子2/抗氧化反应元件(nuclear factor erythroid-2-related factor2/antioxidant response element,Nrf2/ARE)信号通路相关因子的表达,探究其改善冠脉微循环障碍的机制,为临床应用提供理论依据㊂本动物实验已通过新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准(IACUC-20170222027)㊂
1㊀材料
1.1㊀动物
SPF级雄性SD大鼠36只,体质量(180ʃ20)g,购自新疆医科大学动物实验中心,实验动物许可证号SYXK(新)2018-003,饲养于新疆医科大学动物实验中心SPF级环境中㊂
1.2㊀药物
天香丹组成:红景天㊁新塔花㊁丹参㊁降香等,并由新疆华世丹药业有限公司制备(批号18091201,每袋9g,含生药量3.125g);尼可地尔(批号N0837,上海梯希爱公司)㊂
1.3㊀试剂及仪器
戊巴比妥钠(批号P3761),Sigma公司;月桂酸钠(批号BCBBV3875),Sigma公司;苏木素(批号ZLI-9610),中杉金桥公司;伊红(批号ZLI-9613),中杉金桥公司;马休黄-酸性品红-苯胺蓝(批号G2040),索莱宝公司;Nrf2(批号E-AB-33607),伊莱瑞特公司;Keap1(bs-4648R)㊁NQO1(bs-23407R),博奥森公司;正常山羊血清工作液(批号ZLI-9028)㊁兔SP试剂盒(批号SP-9001),中杉金桥公司;DAB显色试剂盒(批号ZLI-9018);飞利浦HD11XE超声诊断仪;泰盟HX-300S动物呼吸机, JEM-100CXII型透射电子显微镜㊂
2㊀方法
2.1㊀动物建模及分组
SPF级雄性成年SD大鼠27只,体质量180ʃ20 g腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉㊁备皮㊁消毒后气管插管以辅助通气㊂开胸暴露心脏及主动脉根部,使用一次性1mL BD胰岛素针刺入左心室(以有回血为准),迅速注入2mg/kg月桂酸钠,同时夹闭主动脉升部与主动脉弓连接处10s,关胸复苏㊁喂养㊂术中全程无菌操作,术后腹腔注射青霉素3d 预防感染㊂术后将存活下的手术大鼠随机分为模型组㊁尼可地尔组㊁天香丹组,并设空白对照组大鼠9只㊂
2.2㊀给药剂量
大鼠给药剂量g/(kg㊃d)=成人每日剂量(g)ˑ大鼠体表面积/人体表面积[3],天香丹组大鼠给予0.9408(X)2/3g/d天香丹颗粒灌胃㊂尼可地尔组给予0.7840(X)2/3mg/d尼可地尔溶入生理盐水中灌胃,X代表大鼠体质量kg;空白对照组㊁模型组给予每日灌胃生理盐水,每只大鼠给药体积均为2mL/ d㊂自大鼠术后第二天开始,每日给药1次,每周按体质量调整给药量,共给药28d㊂各组大鼠均自由饮水饮食,不限制活动㊂
2.3㊀超声心动图检测
给药28d后,在全身麻醉的状态下将其固定后行超声心动图检测㊂大鼠胸前区备皮,涂以耦合剂,超声探头对准胸部第3㊁4肋间扫描,以M型超声心动图连续测量3个不同心动周期左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)㊁左室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter,LVESD)并取平均值㊂按照公式左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)=(左室舒张末期内径3-左室收缩末期内径3)/左室舒张末期内径3ˑ100得到各组大鼠左室射血分数以评价心功能㊂2.4㊀光镜检查
超声心动图检测完成后大鼠开胸取出心脏,修剪去除心耳及主要大血管,沿心脏中线切为一半,投入中性甲醛溶液中固定48h㊂石蜡包埋后,将组织切成4μm厚的切片,行HE染色及马休黄-酸性品红-苯胺蓝染色,观察微血栓的形成㊂
2.5㊀透射电镜检查
取大鼠心肌组织,4ħ下修剪为约1mm3的组织块,2.5%戊二醛固定液中固定24h,经过脱水㊁渗透㊁包埋制成切片,染色后透射电镜下观察心肌细胞超微结构变化㊂
2.6㊀免疫组化检测
采用免疫组化法检测心肌组织中核转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor2,Nrf2)㊁Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1 (Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)㊁醌氧
化还原酶1[NAD (P )H :quinone oxidoreductase 1,NQO1]的表达㊂一抗稀释倍数为Nrf 2(1:50)㊁Keap1(1ʒ50)㊁NQO1(1-50)㊂每组切片中任选1张作为阴性对照,使用0.01mol /L PBS 代替一抗进行染色㊂每张切片随机选取5个视野,以细胞胞浆㊁胞质㊁胞核中出现黄色或棕褐色颗粒判断有阳性反应,采用Image pro plus 软件进行分析㊂
2.7㊀统计学方法
采用SPSS22.0统计软件进行统计分析,数据以均数ʃ标准差(
x ʃs)表示,组间比较采用t 检验,多样本均数比较采用单因素方差分析,P <0.05为差异有统计学意义㊂
3㊀结果
3.1㊀心功能检测
表1示,与空白对照组比较,模型组大鼠LVEDD ㊁LVEF 均降低(P <0.05);与模型组比较,尼可地尔组LVEF 升高(P <0.05),天香丹组LVEDD ㊁LVEF 升高(P <0.05),天香丹组与尼可地尔组LVEDD ㊁LVESD ㊁LVEF 比较差异无统计学意义(P >0.05)㊂
表1㊀各组大鼠心功能比较(
x ʃs )㊀组别鼠数LVEDD (mm )LVESD (mm )LVEF (%)
空白对照组
97.30ʃ0.46 4.21ʃ0.4981.67ʃ4.86模型组9 6.85ʃ0.43∗
4.56ʃ0.6270.32ʃ3.42∗尼可地尔组97.16ʃ0.31 4.17ʃ0.3280.92ʃ3.92#天香丹组9
7.71ʃ0.35#
3.98ʃ0.41
83.13ʃ4.21#㊀㊀注:与空白对照组比较:∗P <0.05;与模型组比较:#P <0.05
㊀㊀3.2㊀心肌组织病理学变化
图1示,HE 染色结果显示,空白对照组未发现微血栓,偶尔可见少量红细胞㊂模型组大鼠冠脉微血管内分布着由红细胞㊁血小板和纤维蛋白构成的红色或白色血栓混合物,并可见心肌细胞纤维化㊂与模型组比较,尼可地尔组㊁天香丹组微血栓程度均
有不同程度减轻,心肌排列正常㊂
图2示,马休黄-酸性品红-苯胺蓝染色显示,冠脉微血管内微血栓的成分多由红色纤维素和蓝色纤维蛋白组成㊂空白对照组未见微血栓,模型组栓塞程度较重,尼可地尔组及天香丹组微血管内血栓均有不同程度减轻
㊂
注:a.空白对照组;b.模型组;c.模型组心肌细胞;d.尼可地尔组;e.天香丹组;f.天香丹组心肌细胞
图1㊀各组冠脉微血管HE 染色图像(a ,b ,c ,d ,e ,f ˑ400)
㊀㊀3.3㊀透射电镜观察
图3示,空白对照组透射电镜图像可见心肌细胞排列整齐,结构良好㊂模型组可见心肌细胞闰盘间隙过大,心肌细胞破裂,线粒体絮状改变,内部复杂性降低,并可看到Z 线明显不平㊂尼可地尔及天香丹治疗后减轻了线粒体损伤,心肌细胞排列较整齐,Z 线略平,闰盘正常㊂
3.4㊀免疫组化检测
图4表2示,与空白对照组比较,模型组Keap1表达升高(P <0.05);与模型组比较,天香丹组及尼
可地尔组Keap1表达均降低(P <0.05),天香丹组Nrf2㊁NQO1表达升高(P <0.05)㊂与尼可地尔组比较,天香组Nrf2㊁NQO1表达均升高(P <0.05)㊂
4㊀讨论
冠脉微循环障碍是指在多种因素的作用下,冠状前小动脉和小动脉结构与(或)功能异常所致劳力性心绞痛或心肌缺血的临床综合征[4]㊂研究发现,冠脉微循环障碍可表现为冠脉无复流㊁慢复流㊁X 综合征㊁缺血再灌注损伤等[5-6]㊂月桂酸钠具有强烈的内皮损伤作用,可造成血管内皮的脱落甚至穿
孔㊂本研究使用月桂酸钠作为内皮损伤剂行左心室内注射制作冠脉微循环障碍动物模型,更贴近临床
病理生理实际情况[7]
㊂
注:a.空白对照组;b.模型组;c.模型组心肌细胞;d.尼可地尔组;e.天香丹组;f.天香丹组心肌细胞
图2㊀各组冠脉微血管马休黄-酸性品红-苯胺蓝染色比较(a ,b ,c ,d ,e ,f ˑ200
)
注:En.血管内皮(vascular endothelial );Er.红细胞(red blood cell );M.线粒体(mitochondrion );Id.闰盘(intercalated disc )
注:a.空白对照组;b.模型组;c.模型组闰盘;d.尼可地尔组;e.天香丹组;f.天香丹组闰盘
图3㊀透射电镜下心肌细胞超微结构改变比较(a ,b ,c ,d ,e ,f ˑ15000)
表2㊀各组大鼠心肌免疫组化染色中IOD 值比较(
x ʃs )组别鼠数Nrf2Keap1NQO1空白对照组930.79ʃ12.2817.83ʃ 2.8535.60ʃ 6.46模型组950.93ʃ19.1834.94ʃ11.78∗
58.99ʃ7.74
尼可地尔组9160.60ʃ24.15#56.09ʃ11.52#
108.15ʃ12.20天香丹组
9
225.54ʃ9.22
#
86.83ʃ14.63#584.05ʃ85.89#
㊀㊀注:与空白对照组比较:∗P <0.05;与模型组比较:#P <0.05
㊀㊀心脏超声心动图检测LVEF 值能够准确反映大
鼠的心脏功能,在不使用侵入性方式或放射性示踪剂的情况下,超声心动图是非侵入性冠状动脉血流评估的替代方案之一[8-9]㊂本研究发现,模型组大鼠LVEF 降低,尼可地尔组及天香丹组大鼠心功能恢复正常㊂结合文献及本研究结果,其可能的原因为冠脉微血管内出现微血栓,伴随心肌发生纤维化,
心肌细胞缺血缺氧导致心功能降低㊂尼可地尔及天香丹能够改善心肌缺血,从而提高心功能[10-11]㊂
研究表明,Nrf2及其下游NQO1的表达上调是激活Nrf2/ARE 信号通路的标志[12-14]㊂当发生过氧化时Nrf2与Keap1解偶联,解离的Nrf2进入胞核,激活Nrf2/ARE 信号通路,调控下游抗氧化元件NQO1㊂NQO1能够还原醌类及其衍生物,阻止其产
注:a.空白对照组;b.模型组;c.尼可地尔组;d.天香丹组
图4㊀各组大鼠心肌免疫组化染色中Nrf2㊁Keap1㊁NQO1表达比较(a,b,c,dˑ00)
生活性氧并降低其毒性,从而减轻氧化应激反应[15-16]㊂中西药都可通过Nrf2/ARE信号通路发挥改善微循环障碍的作用㊂如齐欣[17]研究发现,益气活血药能通过激活Nrf2/ARE通路表达,并达到改善冠脉微循环障碍的作用㊂白雪思等[18]发现,川芎嗪联合卡波金通过上调Nrf2的磷酸化程度㊁下调Keap1的表达而发挥抗氧化作用,改善微循环障碍㊂本研究中,与模型组比较天香丹组Nrf2及其下游NQO1的表达增强,从而证实天香丹激活Nrf2/ARE 信号通路㊂
冠脉微循环障碍属于中医学 胸痹 真心痛 等范畴㊂研究发现,川芎嗪㊁麝香保心丸等中药提取物或中成药均能改善微循环,提高组织灌注水平[19-23]㊂天香丹为 通补开泄法 治疗冠心病的代表方㊂前期研究表明,可改善冠心病患者的胸闷㊁胸痛㊁心悸等症状[24]㊂本研究显示,冠脉微循环障碍发生时,微血管内出现微血栓,心肌超微结构发生改变㊂天香丹能够减轻月桂酸钠诱导的冠脉微血管内血栓程度,上调Nrf2㊁NQO1的表达,对Nrf2的负调控因子Keap1产生抑制作用㊂这可能与激活Nrf2/ ARE信号通路有关㊂
本研究阐释了天香丹改善冠脉微血栓㊁提高心功能的机制,为天香丹防治冠脉微循环障碍提供理论依据㊂本研究还需进一步从天香丹是否调控Nrf2/ARE信号通路下游因子的表达,减轻氧化应激反应,而改善冠脉微循环障碍进行探讨㊂
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收稿日期:2020-07-17
(上接第537页)
以甘寒为主要思路,最终取得 身凉气平,不渴不烦不泻 [5]117之良效㊂又如‘寓意草㊃辨袁仲卿小男死症奇验并详诲门人“中,对于袁氏小儿伤寒夹食滞,他医误以金石重坠导致外邪深入,神识不清㊂喻嘉言在运用理中运转前药㊁玄明粉通下燥结之后,针对小儿 但求酒吃 而仍然不省人事之症, 以生津药频灌 ,终得其 一日而苏醒 [5]22㊂
2.4㊀ 以甘寒护中气 治热病大虚之候
‘灵枢㊃邪气脏腑病形“有言: 诸小者,阴阳形气俱不足,勿取以针而调以甘药也㊂[1]488 喻嘉言遵从‘黄帝内经“,从护中州元气的角度立法,其指出在大虚之候,应重视甘药的运用㊂如‘医门法律㊃先哲格言“云: 阴阳形气俱不足,勿取以针,而调以甘药 然用之者,但当微兼五味,而以甘为主,庶足补中㊂如四气无土气不可,五脏无胃气不可㊂[4]60 ‘医门法律㊃虚劳门“云: 病气不足,懒语困弱,是正气内亏,视外邪暗助,精神反增者迥殊㊂此不可刺,宜补之以甘药,甘药正稼穑作甘,培补中央,以灌输脏腑百脉之良药 [4]318,均在论述甘味入中土,中土为后天之本,气血生化之源,其意在强调甘味药物对虚证之重要性㊂
甘药有甘温与甘寒之别,大多数情况下,在元气虚衰㊁无明显热势之时,喻嘉言重于 甘温 法;若病者自伤寒化热而来,或病中邪热炽盛,为大虚之候,喻嘉言则提倡以甘寒护气㊂
首先,喻嘉言在治疗中体现了甘寒护气的观点㊂如‘寓意草㊃治叶茂卿小男奇证效验并详诲门人“中患者肺热壅盛,痘不成浆,皮薄不脱,后小肠突出脐外,茎物绞长八九存,一派危象之时㊂喻嘉言用梨汁温服㊁梨汁伍黄芩㊁黄芩伍阿胶等取效[5]115,体现甘寒润燥㊁清热保津㊁可存正气于危难之时的思想㊂如其于‘寓意草㊃治钱仲昭伤寒发斑危症奇验“中云: 盖中州元气已离,大剂急剂复剂俱不敢用㊂而虚热内炽,必甘寒气味,方可和之耳㊂[5]31 在此案中,对于病家经伤寒误治后,阳明胃经表里不清㊁遍身红斑㊁神昏谵语㊁食饮不入㊁大便复秘㊁小便热赤之危症,喻嘉言以白虎汤 一昼夜频进五七剂,为浸灌之法 ,最终使病者热退神清,脉和食进,转危为安㊂
再者,喻嘉言在此处多呈现为善后调理思想㊂如‘寓意草㊃辨痢疾种种受症不同随证治验“中,朱孔阳患痢疾,毒火内郁焚灼脏腑,胃气留存一线之时㊂喻嘉言提出首以大黄㊁黄连等大苦大寒之剂 随滚随服以救急 泻除热毒得效后,邪已去十之八
九,而喻嘉言提出此时更需以天花粉㊁牡丹皮㊁赤芍㊁甘草等甘寒之品生津养血,以 回其一时枯槁 [5]48㊂又如‘寓意草㊃详述陆平叔伤寒危症治验并释门人之疑“中,对于陆平叔伤寒误补误清之后,手足掣动,欲成痿证,喻嘉言从 阳明主万物所归 阳明者,十二经脉之长也,主润宗筋 的角度,首以防风通圣散化裁,大队苦寒之品通泄阳明,后急以大剂白虎合黄芩㊁黄柏㊁栀子㊁连翘等,取白虎汤乃甘寒重剂,可制内炽之虚热,护中州元气之义㊂最终又以甘寒轻法,略作调和, 以葳蕤二冬,略和胃气 [5]42收尾㊂综上可以看到,喻嘉言在热病大虚以及邪热退㊁正虚显之时,往往推崇以甘寒之品护卫中气㊂3　结语
多数医家对甘寒药物的认识都停留在甘寒可 清热生津 的层面上,而喻嘉言不泥古人,法自‘黄帝内经“ 风淫于内,治以辛凉 [1]之说,开创 风淫于内,治以甘寒 [4]234之甘寒通络的代表性学术思想,并推衍出甘寒性味药物的诸多功用㊂
从其著作中我们可窥见,对于甘寒药物的运用,喻嘉言的学术思想以 胃为阳明燥土 为核心,由于其本身易于化燥伤阴,又易为外邪所并合而化热㊂因此,喻嘉言重视保全胃中津液,如 人身天真之气,全在胃口,津液不足即是虚,生津液即是补虚 [5]35,具体提出 甘寒护胃 保全中州元气的思想,常用药物如生地黄㊁麦门冬㊁天花粉㊁竹沥㊁梨汁㊁蔗浆等,并由此提出 中土运-营卫和-邪不犯 的学术观点,在临床上常常获得较好疗效,值得我们学习㊂
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收稿日期:2020-02-19。