5-氟尿嘧啶气雾对人胃癌细胞MKN-45增殖、凋亡及周期的影响

5-氟尿嘧啶气雾对人胃癌细胞MKN-45增殖、凋亡及周期的
影响
林填;余江;魏志刚;胡彦锋;王亚楠;李国新
【摘要】目的通过体外模拟5-氟尿嘧啶(5-Fu)腹腔气雾化疗环境,评价5-Fu雾化对人胃癌细胞MKN-45增殖、凋亡及周期的影响.方法运用自主研发的气雾化疗仪将5-Fu雾化,体外模拟腹腔气雾化疗环境,对胃癌细胞进行处理,维持气雾环境压力为8 mmHg,作用时间为30 min,并设生理盐水雾化作为对照,处理后用MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期.结果 MTT结果显示,5-Fu 气雾化疗组杀伤率显著高于生理盐水组[(31.13±3.51)%比
(4.65±1.99)%,P<0.001];流式细胞结果显示,与生理盐水组相比,5-Fu气雾化疗组细胞凋亡率升高[(12.00±0.92)%比(2.65 ±0.52)%,P<0.001)],G1期细胞增多[(51.83±1.95)%比(36.41±2.33)%,P<0.001]、S期细胞减少[(16.72±2.36)%比(45.20±3.27)%,P<0.001],差异均有统计学意义.结论 5-Fu气雾能有效抑制胃癌细胞的增殖并诱导凋亡,使细胞阻滞于G1期,为气雾化疗的临床应用提供实验依据.%Objective To evaluate the effect of simulated intraperitoneal 5-fluorouracil (5-Fu) aerosol chemotherapy (AIPC) on the proliferation, apoptosis, and cell cycle of human gastric cancer cell line MKN-45 in vitro. Methods The gastric cancer cells MKN-45 were treated with 5-Fu aerosol for 30 min under the pressure of 8 mmHg, and those treated with normal saline (NS) aerosol served as the control. The cell proliferation after the treatment was detected by MTT assay, and flow cytometry and FITC Annexin V/PI kit were used to detect the cell apoptosis and changes in the cell cycle. Results MTT assay showed a significantly, greater inhibition rate
of the cell proliferation in 5-Fu aerosol group than in NS group [(31.13±3.51)% vs (4.65±1.99)%, P0.001]. FCM analysis also showed a significantly higher cell apoptotic rate in 5-Fu aerosol group than in NS group [(12.00±0.92)% vs (2.65±0.52)%, P0.001]. Compared with saline treatment, treatment with 5-Fu aerosol resulted in a greater proportion of Gl phase cells [(51.83±1.95)% vs (36.41± 2.33)%, P0.001] with a lowered proportion of S phase cells [(16.72±2.36)% vs (45.20+3.27)%, P0.001]. Conclusion Simulated 5-Fu AIPC can inhibit the proliferation, induce cell apoptosis and cause cell cycle arrest at Gl phase in gastric cancer cells.【期刊名称】《南方医科大学学报》
【年(卷),期】2011(031)006
【总页数】3页(P1066-1068)
【关键词】5-氟尿嘧啶;腹腔气雾化疗;胃癌细胞;MKN-45;凋亡
【作者】林填;余江;魏志刚;胡彦锋;王亚楠;李国新
【作者单位】南方医科大学南方医院普通外科,广东,广州,510515;南方医科大学南方医院普通外科,广东,广州,510515;南方医科大学南方医院普通外科,广东,广州,510515;南方医科大学南方医院普通外科,广东,广州,510515;南方医科大学南方医院普通外科,广东,广州,510515;南方医科大学南方医院普通外科,广东,广
州,510515
【正文语种】中文
【中图分类】R735.2
胃癌是我国常见的恶性肿瘤，目前的治疗是以手术为主的综合性治疗，但是经过根治术后，仍有约半数的患者5年内出现复发和/或转移，直接影响到患者的长期生存率，腹腔内游离癌细胞（free cancer cell,FCC）和微小癌灶的存在是造成复发转移的主要原因之一［1-2］。

而近年广泛应用于胃肠肿瘤外科的腹腔镜手术过程中气腹介质的作用可能使腹腔内游离癌细胞播散种植的危险性增大［3］。

因此，我们设想采用一种新的治疗方法，能够在腹腔镜手术气腹过程中同时进行化疗药物雾化治疗，以期有效杀灭术中游离癌细胞，为探讨该设想的可行性和有效性，本实验运用自行研发的气雾化疗仪，模拟5-Fu腹腔气雾化疗环境，用人胃癌细胞MKN-45进行体外实验。

低分化人胃腺癌细胞MKN-45（购于中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所生物检测中心肿瘤细胞库）。

噻唑蓝（MTT）（Sigma）、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（Keygen）、细胞周期检测试剂盒（Keygen）。

气腹机（STORZ）、气雾化疗仪。

1.2.1 胃癌细胞培养低分化人胃腺癌细胞MKN-45培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，培养条件为37 ℃，5%CO2。

1.2.2 5-Fu气雾压力瓶的制作选用容量为1 L的负压吸引瓶，其盖上有两小孔，用其中一个作为进气孔，连接5-Fu气雾化疗仪，另外一个作为测压孔，连接气腹机，检测瓶内压力，另再自行设一小孔作为出气孔，通过气雾化疗仪和出气孔来调节负压瓶内的压力。

1.2.3 分组取对数生长期单细胞悬液（胃癌细胞MKN-45）以每孔4×103接种于96孔培养板（流式细胞实验为6孔板），37℃、5%CO2培养箱中培养，贴壁后换液，继续培养8 h后弃培养液，转移至压力瓶中（预先置于生物安全柜中紫外线消毒60min），连接气雾化疗仪和气腹机，开放出气孔。

随机分成两组：5-Fu雾化组：将0.1mmol/L 5-Fu溶液雾化后通过进气孔进入压力瓶内，调整气雾压力
为8mmHg，作用时间为30min；生理盐水雾化组：将生理盐水雾化后通过进气
孔进入压力瓶内，作用压力及时间同5-Fu雾化组。

雾化处理后取出培养板，分别加入培养液，放回培养箱中继续培养。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖 5-Fu雾化组和生理盐水雾化组处理后放回培养箱中继续培养24 h，每组设4个复孔，弃培养液，每孔加入5 mg/ml的MTT，继续培
养4 h后吸出培养液和MTT溶液，每孔加入DMSO 150μl，微孔板振荡器振荡
10min后用酶联免疫检测仪测定490 nm的吸光度（OD）值，并分别计算杀伤率。

杀伤率（%）=（1-处理孔OD值/对照孔OD值）×100%。

整个实验重复3次。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 5-Fu雾化组和生理盐水雾化组处理后放回培养箱
中继续培养24 h，每组设3个复孔，收集细胞，用PBS洗涤，加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞，然后加入5μl AnnexinV-FITC混匀，再加入5μl PropidiumIodide，混匀，室温、避光反应15min，使用流式细胞仪检测凋亡细
胞所占比例。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞周期变化取常规条件下培养的对数生长期单细胞悬液以每孔5×104接种于6孔培养板，用无血清RPMI 1640培养基同步化后分别用气
雾化疗仪进行处理，5-Fu雾化组和生理盐水雾化组处理后分别加入培养基，放回
培养箱中继续培养24 h，每组设3个复孔，收集细胞，用PBS洗涤并计数，调整为1×106/ml的单细胞悬液，用70%乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS洗去固
定液，加100μl RNase A 37℃水浴30min，再加入400μl PI染色混匀，4 ℃避
光30min，流式细胞仪检测，根据相对不同DNA含量的细胞分布图，拟合出各
周期细胞的百分率。

1.2.7 统计应用SPSS13.0统计软件，数据以均数±标准差表示，采用两独立样本
t检验进行统计处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

MTT结果显示，5-Fu雾化组对细胞的杀伤率比生理盐水组大，差异有统计学意义
（P＜0.001，表1）。

FCM结果显示，5-Fu雾化组细胞凋亡率显著高于生理盐水组（P＜0.001，表1，图1）。

FCM结果显示，5-Fu雾化组MKN-45细胞阻滞于G1期，与生理盐水组比较有统计学差异（P＜0.001，表1）。

近年来，腹腔镜手术因术后疼痛轻、胃肠功能恢复快及对机体免疫功能影响小等明显的微创优势而逐渐应用于胃肠肿瘤外科，腹腔镜手术一般需要建立人工CO2气腹以显露视野，而气腹的涡流作用可能使腹腔内游离癌细胞播散种植，造成术后手术野区域、腹膜表面及肝脏等部位的广泛复发和/或远处转移。

腹腔内游离癌细胞和微小癌灶的存在是造成复发转移的主要原因之一。

因此，如何有效杀灭脱落的腹腔内游离癌细胞和不能完全手术切除的微小癌灶成为防治腹腔镜胃肠道恶性肿瘤术后复发和/或转移的关键。

目前，临床上较多采用腹腔化疗作为胃肠癌辅助治疗，其具备独特的药代动力学优势特征，治疗效果明显［4］。

因此我们设想，在保留腹腔化疗药代动力学特点的基础上，结合腹腔镜气腹这一特点，在腹腔镜手术过程中将化疗药物雾化后注入腹腔进行腹腔内化疗，化疗药物在气雾状态下与癌细胞充分接触，既符合传统腹腔化疗原理［5］，又较传统的腹腔灌注化疗更广泛的接触腹膜和腹腔内的游离癌细胞及残存的微小癌灶，直接杀灭癌细胞，达到防治胃肠癌术后复发和/或转移的目的。

我们已经证明了腹腔气雾化疗具有高选择性区域化疗药代动力学特征，能使高浓度的化疗药物直接与癌细胞充分接触，有明确的药代动力学优势［6］，但是否能有效杀灭癌细胞，目前国内外尚未见报道。

本实验运用自行研发的气雾化疗仪，体外模拟5-Fu腹腔气雾化疗环境，应用气雾化疗仪将5-Fu雾化后作用于胃癌MKN45细胞，并与生理盐水组进行比较，研究其疗效。

本实验MTT结果显示，5-Fu气雾化疗组杀伤率为31.13%，生理盐水组杀伤率为4.65%，P=0.000，表明5-Fu雾化能有效抑制胃癌细胞MKN-45的增值。

流式
细胞结果显示，5-Fu气雾化疗组细胞凋亡率为12.00%，显著高于生理盐水组
2.65%，P=0.000，表明5-Fu雾化能诱导细胞凋亡。

流式细胞结果还显示，5-Fu 雾化对胃癌细胞MKN-45细胞各周期均有影响，本实验所选化疗药物5-氟尿嘧啶为细胞周期特异性药，主要抑制S期细胞，在细胞内转变为5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸，后者抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸，从而抑制DNA合成，阻滞G1期细胞向S期转化进程，造成G1期细
胞阻滞［7］。

根据本实验细胞周期结果，可认为5-Fu雾化能使G1阻滞，抑制S 期细胞。

本实验结果提示5-Fu腹腔气雾化疗对减少癌细胞腹腔内种植具有可行性。

腹腔气雾具备腹腔化疗的药代动力学特征，能在腹腔镜手术过程中同时进行，有效杀灭肿瘤细胞，有望成为腹腔镜胃肠癌术后腹腔复发和/或转移的防治新方法。

本研究的主要局限在于：本实验为体外实验，一是模拟环境并不能完全代表腹腔环境，5-Fu气雾在体内对癌细胞的作用和在体外对癌细胞的作用并不完全一致；二
是未能对其安全性进行研究，下一步我们将通过动物实验进行进一步研究，为气雾化疗的临床应用提供实验依据。

【相关文献】
［1］Wang Z,Zhang X,XuH,etal.Detection of peritoneal micrometastasis by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for heparanase mRNA and cytology in peritoneal wash samples［J］.J Surg Oncol,2005,90(2):59-65.
［2］Sugarbaker PH.Adjuvant intraperitoneal chemotherapy for advanced primary gastric cancer［J］.Scand J Surg,2006,95(4):270-3.
［3］Shen MY,Huang IP,Chen WS,et al.Influence of pneumoperitoneum on tumor growth and pattern of intra-abdominal tumor spreading:in vivo study of a murine model
［J］.Hepatogastroenterology,2008,55(84):947-51.
［4］Yan TD,Black D,Sugarbaker PH,et al.A systematic review and meta-analysis of the randomized controlled trials on adjuvant intraperitoneal chemotherapy for resectable gastric cancer［J］.Ann Surg Oncol,2007,14(10):2702-13.
［5］Zanon C,Bortolini M,Chiappino I,et al.Cytoreductive surgery combined with intraperitoneal chemohyperthermia for the treatment of advanced colon cancer ［J］.World J Surg,2006,30(11):2025-32.
［6］何炜,魏志刚,李国新,等.5-氟尿嘧啶腹腔气雾化疗的药代动力学及组织分布［J］.中华实验外科杂志,2011,28(1):3.
［7］Bartek J,Lukas J.Mammalian G1-and S-phase checkpoints in response to DNA damage［J］.Curr Opin Cell Biol,2001,13(6):738-47.
（编辑：陈望忠）。