UV紫外分光光度计

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溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会 引起偏离。其中有色化合物的离解是偏离朗伯— 比尔定律的主要化学因素。例如，显色剂KSCN与 Fe3+形成红色配合物Fe(SCN)3，存在下列平衡： Fe(SCN)3 Fe3++3SCN－ 溶液稀释时，上述平衡向右，离解度增大。所以
当溶液体积增大一倍时，Fe(SCN)3的浓度不止降
(1-1)
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透光度、吸光度与溶液浓度及液层宽度的关系
I0 1 A lg lg kbc I T
（1-2）
溶液浓度与宽度的乘积与吸光度成正比，而不是与 透光度成正比。以上两式中k是比例系数，与入射光波长 、溶液的性质及温度有关。当入射光波长和溶液温度一 定时，k代表单位浓度的有色溶液放在单位宽度的比色皿 中的吸光度.。当c的单位为g· L-1，b的单位为cm时，k以a 表示，称为吸光系数 (absorption coefficient) ，其单 位为L· g-1· cm-1，此时式（9-3）变为
A abc
(1-3)
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如果浓度c的单位为mol· L-1，b的单位为cm，这时k常用 表 示 。 称 为 摩 尔 吸 光 系 数 (molar absorptivity) ， 其 单 位 为 L· mol-1· cm-1 ，它表示吸光质点的浓度为 1mol· L-1 ，溶液的宽度为 1cm时，溶液对光的吸收能力。 值越大，表示吸光质点对某波 长的光吸收能力愈强，故光度测定的灵敏度越高。值在103以上即 可进行分光光度法测定，高灵敏度的分光光度法可达到105~106。 于是式（1-1）可写成为： A=εbc （1-4） ε与a的关系为： ε=Ma （1-5） 式中M为吸光物质的摩尔质量
2、透射比准确度及透射比重复性
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3、杂散光
4、波长边缘噪声
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5、电源电压变化时引起的透射比变化
电源电压220 V变化+22 V时所引起透射比示值变 化不应超过下表的要求。
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2nochromator) ：其作用是将光源辐射 的复合光分解成按波长顺序排列的单色光。包 括狭缝和色散元件及准直镜三部分。色散元件 用棱镜或光栅制成。光栅其特点是工作波段范 围宽，适用性强，对各种波长色散率几乎一致。 光栅由玻璃片或金属片制成，其上准确地刻有 大量宽度和距离都相等的平行线条（刻痕）， 可近似地将它看成一系列等宽度和等距离的透 光狭缝。
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分光光度计的主要类型
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1.单光束：经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液 和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计 结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。 2.双光束：经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光， 一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束 光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换 成吸光度并作为波长的函数记录下来。快速全波段扫描。可 消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适 合于结构分析。仪器复杂，价格较高。 3.双波长：由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单 色器，得到两束不同波长（1和2）的单色光；利用切光器 使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，然后经过光电 倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的 吸光度差值Δ A。对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织 液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下， 利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。 13 利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。
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吸收池(absorption cell)又称比色皿，是由无 色透明的光学玻璃或熔融石英制成，用于盛装 试液或参比溶液。 玻璃吸收池：在见光范围内使用。
石英吸收池：在紫外光范围内使用。
吸收池，通常有0.5cm、1cm、2cm、3cm和5cm宽 ，可适用于不同浓度范围的试样测定。同一组 吸收池的透光率相差应小于0.5%。
紫外—可见分光光度计
Ultraviolet and Visible Spectrophotometer
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概述
分光光度法是基于物质分子对光的选择性吸收 而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长 不同，可分为可见分光光度法、紫外分光光度 法及红外分光光度法。 特点： * 灵敏度较高（ 1~10mg· L-1 ），适用于微量组分 的测定。但相对误差较大（2~5%）。 * 具有操作方便、仪器设备简单、灵敏度和选 择性较好等优点，为常规的仪器分析方法。
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由于溶液本身的原因所引起的偏离
吸光系数 k 与溶液的折光指数 n 有关。溶液浓度在 0.01mol· L-1 或 更低时， n 基本上是一个常数， 说明朗伯一比尔定律只适用于低 浓度的溶液。浓度过高会偏离朗 伯一比尔定律。 朗伯 —比尔定律是建立在均匀 、非散射的溶液这个基础上的。 如果介质不均匀，呈胶体、乳浊 、悬浮状态，则入射光除了被吸 收外，还会有反射、散射的损失 ，因而实际测得的吸光度增大， 导致对朗伯—比尔定律的偏离。
偏离朗伯一比尔定律的原因
定量分析时，通常液层
厚度是相同的，按照比尔
定律，浓度与吸光度之间 的关系应该是一条通过直
角坐标原点的直线。但在
实际工作中，往往会偏离 线性而发生弯曲。若在弯 曲部分进行定量，将产生 较大的测定误差。
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单色光不纯所引起的偏离
朗伯一比尔定律只对一定波长的单色光才 能成立，但在实际工作中，即使质量较好的分 光光度计所得的入射光，仍然具有一定波长范 围的波带宽度。在这种情况下，吸光度与浓度 并不完全成直线关系，因而导致了对朗伯一比 尔定律的偏离。所得入射光的波长范围越窄， 即“单色光”越纯，则偏离越小。
lgT=-0.4343=A 即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小
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紫外—可见分光光度法应用实例
应用: • 测量试样微量组分 • 测定配合物的组成及稳定常数、弱酸 的解离常数、化学反应的速率常数、催 化反应的活化能等. • 根据分子的紫外光谱数据判断分子的 空间构型，确定分子结构。
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1、波长准确度和波长重复性
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光的吸收定律—Lambert-beer定律
朗伯—比尔定律 当一束平行的单色光照射到有色溶液时，光的一部分将被溶 液吸收，一部分透过溶液，还有一部分被器皿表面所反射。 设入射光强度为I0，透过光强度为I，溶液的浓度为c，液层 宽度为b，经实验表明它们之间有下列关系：
I0 A lg kcb I
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检测器(detector) 把透过吸收池后透射光强度转 换成电讯号的装置。 检测系统应具有灵敏度高、对透过光的响应 时间短、且响应的线性关系好，对不同波长的光 具有相同的响应可靠性。在分光光度计中常用光 电管和光电倍增管等做检测器。光电倍增管其灵 敏度要比光电管约高200倍。
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显示器(display) 显示器是将检测器检测的 信号显示和记录下来的装置。在分光光度 计中常用的是微安表、数码显示管等。简 单的分光光度计多用微安表。在标尺上有 透光度（ T ）和吸光度（ A ）两种刻度，由 于吸光度和透光度是负对数关系，因此透 光度的刻度是均匀的，而吸光度的刻度是 不均匀的。
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一、 仪器测量条件的选择 1.适宜的吸光度范围 由朗伯-比尔定律可知：
A=lg1/T=ε cl
微分后得： dlgT=0.4343dT/T= -ε ldc 或 0.4343Δ T/T= -ε lΔ c 代入朗伯-比尔定律有： Δ c/c=0.4343Δ T/TlgT
要使测定的相对误差Δ c/c最小，求导取极小得出：
低一半，故吸光度降低一半以上，导致偏离朗伯
—比尔定律。
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紫外—可见分光光度法的误差和测量条件的选择
分光光度法的误差
•溶液不遵守朗伯—比尔定律所引起的误差 利用标准曲线的直线段来测定被测溶液的浓度，从而 减少由入射光为非单色光引起的误差；也可以利用试剂空 白和确定适宜的浓度范围来减少由溶液本身所引起的误差 。 •光度测量误差 吸光度与透光率是负对数关系，故吸光度的标尺刻度 是 不 均 匀 的 。 一 般 来 说 透 光 率 为 20 ％ ~65 ％ （ 吸 光 度 为 0.2~0.7）时，浓度测量的相对误差都不太大。这就是分光 光度分析中比较适宜的吸光度范围。
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•仪器误差 比色皿的质量，检流计的灵敏度。 ，光源不稳定、棱镜的性能、安装条件及 光电管的质量等都可以使分析产生误差。 •操作误差 由分析人员所采用的实验条件与正确 的条件有差别所引起的，如显色条件和测 量条件掌握得不好等。
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•
吸光度读数范围的选择 透光度读数误差ΔT 是一个常数，但在不同的 读数范围内所引起的浓度 的相对误差却是不同的。 因此，为了减小浓度的相 对误差，提高测量的准确 度，一般应控制被测液的 吸光度 A 在 0.2~0.7 （透光 度 为 65%~20% ） 。 当 溶 液 的吸光度不在此范围时， 可以通过改变称样量、稀 释溶液以及选择不同厚度 的比色皿来控制吸光度。
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紫外—可见分光光度计基本构造
光源 单色器 吸收池 检测器
信号显 示系统
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光源(light source) ：
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有 足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区：钨灯、卤钨灯、氙灯，其辐射波长范围在 320～2500 nm。钨灯最适宜的使用波长范围为320～ 1000nm。 紫外区：氢、氘灯。发射185～400 nm的连续光谱。 使用波长范围一般为190～360nm 。