基因工程抗体和基本原理

四.超变区多肽(hypervariable region polypeptides)
抗体抗原结合是经过补体决定区（CDR） 来实现。因此，CDR是构成抗原抗体结合的 最小结构单位。根据这一特点，可以设计出 那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的 CDR多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得 理想的结果。这种只含有一个CDR多肽的抗 体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位 (minimal recognition unit, MRU)。
特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性， 同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的 能力。
人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略
启动子
Pr 鼠VH 人 CH
Pr 鼠VL 人 CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
共转染细胞
Hale Waihona Puke 抗体分泌细胞鼠VH
鼠V L
人CL 人CH
人-鼠嵌合基因工程抗体
第二代的抗体人源化——改型抗体
多肽） 基因工程抗体（双特异、免疫黏连素、催
化抗体） 人源抗体（噬菌体抗体库、转基因小鼠） 人-人抗体
1、抗体人源化 鼠单克隆抗体人源化 ：嵌合抗体、改型抗体 小分子抗体：单价(Fab、ScFv、单域抗体、 超变区多肽)、多价（Di-, Tri-, Minibody） 特殊类型抗体 (双特异性抗体、细胞内抗体、
免疫粘附素(immunoadhension) ：将人抗体
恒定区(主要是Fc段)N-端连接于人细胞表面的受体 分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确 折叠的融合抗体蛋白分子，这种分子可同时发挥抗 体的效应功能及其它相应的效应功能，这种分子又 被称为新效能抗体。
免疫毒素：又称生物导弹，是由导向性的载体分
多价小分子抗体
在ScFv的基础上，可以把两个或两 个以上的ScFv重组在一起，由此可制备 成多价小分子抗体即微型抗体（简称多 价微抗）。其中包括双链抗体(diabody)， 微型抗体（minibody），三链抗体 (triabody)及四链抗体(tetrabody)等。
一、双链抗体(diabody) Ag 制备方法 化学交联法 粘性蛋白结构域融合法 接头长度控制法。
基因工程抗体和基 本原理
根据研究者的意图，采用基因工程方法， 在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、 拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生 新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、 人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体等。
单克隆抗体用于治疗存在的问题
1、单克隆抗体的特异性 由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严 格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应； 2、异种抗体反应 鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应
淋巴瘤
靶抗原
CD3 17-1A 血小板受体 ⅡbⅢa CD20
抗体名称 OKT3 Panorex ReoPro
Rituxan
移植排斥
CD25
Simulect
炎症性肠病、 TNF- а 类风湿
Remicade
抗体来源
鼠单抗 鼠单抗 人－鼠嵌 合抗体 人－鼠嵌 合抗体 人－鼠嵌 合抗体 人－鼠嵌 合抗体
ICM3 IDEC-114 MEDI-507 Smart antiCD3
抗体来源
Human(人源) Humanized (人源化) Humanized Primatized Humanized Humanized( IgG)
临床阶段 Ⅱ Ⅰ，Ⅱ
临床前 Ⅰ Ⅰ Ⅰ/Ⅱ
45
适用病症
风湿性关节 炎
靶抗原
二、三链抗体(triabody)
在制备单链抗体时，当接头的长度为2 个或2个的以下氨基酸残基时，或者直接 把VH结构域的N末端与VL结构域的C末端 相连，通过非共价键而形成的三聚体，称 为三链抗体。接头长度在3～12个氨基酸 残基时，则形成双链抗体。
通过基因工程手段采用 不同的接头把单链抗体(VLVH)的VH结构域与IgG的 CH3结构域融合，形成VLVH-CH3的结构，称之为微 三、微型抗体 型抗体（minibody）。
细胞内抗体的应用：
由于细胞内抗体具有高亲和力及选择结 合特性，因而可通过多种机制调控细胞 的生理过程及代谢。作用机理表现为： • 阻断靶蛋白的活性部位 • 阻断细胞内蛋白－蛋白相互作用 • 干扰细胞内靶蛋白的转运 • 促使靶蛋白降解
六、抗原化抗体（antigenized antibody, AbAg）
根据其价数的不同可分为单价小分子抗体 及多价小分子抗体两种。
单价小分子抗体
一、Fab抗体
Fab段由重链V区及 CH1功能区与整个轻链以 二硫键形式连接而成，主 要发挥抗体的抗原结合功 能。Fab抗体只有完整IgG 的1/3。
二、单链抗体(ScFv)
Ag
定义：用基因工程方法，
将抗体VH和VL（重链和轻链可 变区）通过一个连接肽连接而成 的小分子抗体，
理想的抗体药物的性质
高特异性和高亲和力（Kd=108~1010L/M） 对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排 斥反应 游离抗体不激活补体 一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能 细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行 大规模培养 抗体符合生物制品标准
抗体治疗存在的问题及对策
问题
对策
异源蛋白导致产生抗抗体，• 抗体人源化 影响靶向性和效果
抗原化抗体、免疫脂质体) 抗体融合蛋白 （免疫粘连素、免疫毒素、催
化抗体）
VH和VL是抗原决定簇结 合位点 高变区 HVR
决定簇互补区CDR 骨架区FR CH1和CL：Ig同种异型 的遗传标志 CH2：补体结合位点 CH3：某些细胞Fc受体 结合部位
第一代的抗体人源化—嵌合抗体
从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变 区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性） 基因连接，插入适当表达载体，转染宿 主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。嵌合抗体 由于这两部分在空间结构上相对独立， 其独特的抗体亲和力保持得很好，但因 鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强 的免疫排斥反应。
临床阶段 1986 1995(德国) 1994 1997 1998 1998、1999
43
适用病症 移植排斥 乳腺癌 RVS感染 AML
CLL
靶抗原 CD25 HER-2 RSV F蛋白 CD33
CD52
抗体名称 Zanapax Herceptin Synagis Mylotarg
CAMPATH
抗体来源
子与具有毒性的弹头蛋白交联而制成，属于导向药 物的一种。
偶连细胞毒物质
连接放射性同位素(131I、99mTc） 连接植物或细菌毒素（ricin、PE40） 连接细胞毒性药物（C1027、柔红霉素）
免疫毒素
（α-FcγRI-Ricin A）
Ricin A
CC
Ricin A
SPDP C C SPDP
在嵌合抗体的基础上进一步将 鼠 MAb 可 变 区 中 相 对 保 守 的 FR(framework region)替换成人的FR， 保留与抗原结合部位决定簇互补区 （complement determinant region) 部位 (即CDR移植)
早期的改型抗体：
简单的CDR移植，通过点突变进行微 调即更换某个位点上的氨基酸。
靶部位摄取的量太低
• 改变抗体分子大小
效应功能弱
• 连接毒素、放射性 同位素、药物
在体内被清除速度快
• 抗体人源化
抗体药物改造的方向
抗体人源化和人源抗体制备 改变抗体分子大小 增强抗体亲和力 增强抗体效应功能
单克隆抗体人源化的改进
鼠抗体人源化（人-鼠嵌合、改型抗体） 小分子抗体（Fab、单链、单域、超变区
抗体名称
Complement( 5G1.1 C5)
功能：具有较好的抗原结合能 力，且分子量小、穿透力强、免 疫原性低等特性。可与其他效应 分子构建成多种具有新功能的抗 体分子，是构建免疫毒素和双特 异抗体等的理想而基本的元件 。
ScFv应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 研究基因结构与功能的关系
三、单域抗体
抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定， 因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只 有VH或 VL一个功能结构域，也能保持原单 克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段 就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个 Ig分子的1／12，故也称之为小抗体。
此种抗体合成后通过CH3
(minibody)
结构域形成稳定二聚体式， 发挥其双价微抗作用。
四、双特异性抗体（ BfAb ）
天然Ig是由两个完全相同的VL和VH区域构成， 该区域是特异性识别并结合抗原的关键部位。而 经人工设计构建的双特异性抗体（BsAb）则由两 个不同的抗原结合位点组成，可同时与两种不同 的抗原决定簇结合，并可将其偶连的药物、酶或 放射性核素等导向到靶部位，这种具有双价双特 异性的抗体又称为双功能抗体（bifunctional antibody,BfAb）
人源化抗体 人源化抗体 人源化抗体 人源化抗体 －化疗药物 交联物 人源化抗体
临床阶段 1997 1998 1998 2000
2001
44
正在进行临床开发中的基因工程 抗体
适用病症 银屑病
靶抗原 IL－8 CD11a(IgG1)
ICAM-3 CD80 CD2 CD3
抗体名称 ABX－IL8 Anti-CD11a
AbAg是应用基因工程技术，把编码蛋白 质抗原表位的核苷酸片段插入重链CDR3序列 中进行表达，从而产生具有天然抗原表位构 象和免疫原性的新型抗体。
今后抗体药物发展的方向
寻找新的靶抗原 基于抗原立体结构设计抗体 基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗 体模拟物
最理想的单克隆抗体 100%人源 人类免疫系统自然产生
2 开创人类抗体基因组学的研究 评 价：1 诺贝尔奖得主Dr Milstein 推荐发表在PNAS
2 世界权威杂志“科学”发表了新闻评述 3 剑桥大学开了新闻发布会
未来单抗开发的完美方案
从已知治疗靶子生产高亲和力全人 抗体
全人抗体挑战靶分子的筛选 开发未知抗原的治疗用抗体
已批准上市的单抗
适用病症 移植排斥 大肠癌 冠心病
Ricin A:蓖麻毒素A,对肿瘤细胞具有毒性作用
CH3
scFv IL-2
IL-2
免疫细胞因子(Immunocytokine)
五、细胞内抗体
细胞内抗体主要是指在细胞内合成并作 用于细胞内组分的抗体，亦称内抗体 （intrabody）。
目前的研究主要集中在单链抗体上，在 ScFv的C端或N端插入其它靶向信号 （targeting signals），如分泌信号、核定位 信号、线粒体定位信号和内质网滞留信号等， 从而进行检测、识别、发挥特定功能。
双特异性抗体的特点
* 将免疫细胞锚着于肿瘤部位，提高肿瘤 部位的效靶比。
* 不受MHC的限制，直接激活免疫细胞的 杀瘤机制。
2 1
3
提高抗体效应功能
双特异性抗体
抗体融合蛋白
提高抗体 效应功能
细胞内抗体
偶连细胞毒物质
抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，
所形成的具有新的特性融合蛋白。 根据构建方式的不同，主要分为两种形式： Fc融合蛋白（Fc fusion protein,FcFP）由抗体的Fc
25年来的全人抗体的尝试
• 鼠骨髓瘤不适合与人B细胞融合 – 稳定性差 – 抗体产量低
• 非洲淋巴细胞瘤病毒 (EBV) 保存抗体分 泌细胞 – 细胞株不稳定 – 抗体的产量低 – 不能特异性地保存抗体分泌细胞
• 很难获得人类骨髓瘤细胞株
成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体进入新 的里程
用 途：能稳定的保持人B细胞分泌抗体的能力 发明人：英国剑桥大学的Dr Karpas教授 意 义：1 在整体水平上研究人类产生抗体
段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。 如CD4免疫粘附素，就是由抗体的Fc段与2个CD4 分子的Ig同源区重组而成 抗 原 结 合 融 合 蛋 白 （ antigen-Binding fusion protein,ABFP）由具有抗原结合功能的抗体结构 与其他功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体 部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。
第二代改型抗体： ①应用了人抗体基因库； ②引进计算机技术模拟抗体分子的立
体结构(分子模拟法)； ③使用了鼠人嵌合FR。其目的是获得
具有高亲和力的治疗性抗体
CDR序列
CDR序列
鼠单克隆抗体
人抗体
人源化抗体
鼠单克隆V区人源化（CDR移植）
小分子抗体
人源化抗体属完全的抗体分子。通过基 因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性 的基础上，把完整的抗体分子改造成较小的 分子，称为小分子抗体。