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功能基因筛选方法的研究进展
摘要: 功能基因的筛选研究可为深入了解疾病的发生和发展过程,药物作用机制,建立新的疾病诊断、预防、治疗策略奠定基础,因而正在成为当今药物及药物靶点发现的重要途径。

该领域的迅速发展很大程度上借助于技术方法的不断提高和发展。

本文对功能基因筛选研究策略及主要技术方法,如表达谱分析法、高通量细胞筛选技术、反义核酸技术、转基因/ 基因敲除技术等的研究进展及应用进行了综述。

近年来,随着人类基因组计划的初步完成,后基因组时代蛋白质组学、功能基因组学等研究的深入开展给药物发现领域带来了革命。

基因组庞大规模序列的可利用性、高通量基因表达检测方法的发展及大规模数据分析能力的提高,为药物发现展现了广阔的前景。

然而,新基因不等于新药靶点或新药物。

目前,药物发现的主要挑战之一,就是要快速估测和了解新基因的生物学功能,确定该基因是否能够成为药物靶点或直接作为治疗药物(基因药物或蛋白质药物) ,即进行功能基因的筛选研究。

功能基因的筛选研究正在成为当今药物及药物靶点发现的重要途径,同时也为深入了解疾病的发生和发展过程、药物作用机制以及新的疾病诊断、预防、治疗策略的建立奠定了基础。

这一领域的迅速发展很大程度上借助于众多技术方法的发展和应用,本文对其中一些主要方法及其研究进展进行了综述。

1、功能基因筛选的基本策略
目前,国内外进行功能基因筛选研究的基本策略包括: (1) 通过表达谱差异分析、生物信息学分析和基因克隆等途径获得候选基因; (2) 对候选基因进行功能评价(identification of function ,可在基因组、转录、蛋白质组和代谢产物等水平进行); (3) 基因功能确证(validation of function); (4) 决定开发战略。

1. 1 差异表达筛选功能基因
获得候选基因的研究路线之一是通过正常和疾病组织的表达谱差异分析
(expression profiling of normal and diseased tissues) 获得疾病的相关基因,进一步进行基因功能的筛选研究(图1) 。

该筛选策略与疾病过程密切相关,较多地应用于新药及治疗靶点的发现[1～3 ] 。

1. 2 生物信息学分析
确定候选功能基因获得候选基因的另一研究路线是通过生物信息析 bioinformatic analysis) 预测、选定基因序列、克隆获得候选基因,进一步进行基因功能的筛选研究(图2) [4 ] 。

该研究策略筛选范围广,多用于新基因的功能探索研究。

用于生物信息学分析的数据资料,主要来源于DNA 芯片技术和其他相关技术测定的基因表达信息[4 ] 。

通过与已知基因或蛋白质序列的分析、比较,可以确定候选研究基因序列长度,提供该未知基因产物信号转导通路、细胞结构蛋白类型和细胞定位等预测信息[5 ] 。

然而,由于人类基因组中约1/ 3 的基因序列与其他基因无同源性,因此这些基因的功能不易进行直接预测。

另一方面,蛋白质的功能表现还与其所处的分子环境有关,一种蛋白质实际上与相邻蛋白质形成了功能网
络(functional networks) 。

因此,生物信息学中的功能网络数据库分析,对于了解复杂信号通路及与其他基因产物的关系,可能会提供有价值的参考信息[6 ] 。

1. 3 其他
除上述研究策略外,其他途径的功能基因研究也在进行,如直接从正常或疾病组织中克隆单一未知基因,进行功能研究。

2 、表达谱分析法
表达谱差异分析(differential expression profiling)主要包括基因表达谱
(gene expression profiling) 和蛋白质表达谱(protein expression profiling) [3 ,4 ,7 ] 。

大规模表达谱分析已经成为认识疾病分子机制的有利方法,在癌症研究等方面取得了一定的进展[2～4 ] 。

成功的表达谱分析基于实验及其过程分析的有机结合。

实验过程从关注的疾病开始,首先收集大量的疾病相关组织样本,样本数量可从10 多个到数百个,但必须足以对每一组织类型及个体差异进行比较分析,而且许多情况下不能仅简单地分为正常和疾病组织。

例如,在对糖尿病的研究中,所收集的样本来自健康人、胰岛素耐受和糖尿病病人的不同试验阶段,如胰岛素治疗前后。

样品还应包括其他器官的取材,以便进行基因表达的组织分布研究。

为了便于对后来的实验数据进行分析管理,需采集并储存所有的组织样本和临床参数。

接下来进行组织样本的处理,利用生物芯片(寡核苷酸芯片、cDNA 芯片或全基因组芯片) 进行表达谱测定,并进行生物信息学分析。

通常,表达谱的分析结果需进一步的实验加以证实。

定量RT2PCR 是最灵敏的确证方法,该方法还可以将确证实验的范围扩大到原测组织以外的更广泛的组织和组织类型,揭示基因表达的组
织分布情况。

确证实验揭示了疾病相关基因。

据此,可以进行进一步研究,探索这些基因的功能,开发新的治疗手段。

例如,对于正常和疾病组织中表达有显著性变化的基因,可以进行新治疗靶点的鉴定和确定研究,或利用实验和分析工具研究分析其功能;对于疾病组织中活性升高的酶,可以当作前药活化酶进行鉴定研究。

典型的表达谱能够显示疾病过程中有大量的已知基因表达的改变,而许多已知基因的代谢通路、表达产物酶学分类和蛋白质功能业已发表,将两者对照分析,可以鉴定出酶活性,
选择其中可能成为前药活化酶的部分进行进一步研究;对于疾病特异的蛋白质,可以进行抗原表型分析,决定疫苗的开发策略[1 ] 。

寻找差异表达基因的方法除芯片技术外,一些新的检测方法如差异显示
PCR ( differential display PCR, DD－PCR) 、消减杂交
( suppression subreactive hy bridization , SSH) 等也相继得到结合应用[8 ,9 ] 。

3 、高通量细胞筛选技术
高通量细胞筛选技术(high2throughput cell-based screening technology) 是以高通量方式研究基因功能最有效的方法之一[10 ] 。

通常,基因功能的初步筛选在96 孔或384 孔板上进行,通过基因转染将候选基因导入细胞,或直接将基因表达产物加入细胞培养液中。

筛选测定方法基于要研究的生物学或医学问题,例如,要研究抗血管生成活性,选用内皮细胞进行细胞生长、分化、迁移和粘附等分析测定;研究免疫调节活性,可选择淋巴细胞或造血细胞进行细胞生长和分化的分析测定;研究神经营养因子活性,可选用神经细胞进行细胞存活、突起生长测定。

除上述与细胞表型或形态学相关的检测指标外,细胞信号转导通路、糖代谢、能量产生和代谢产物分析(metabolic control analysis) 等代谢通路也是基因功能重要的研究内容[11 ] 。

结合抗体芯片技术、多路测定技术(multiplexing) 等新的检测方法[12～14 ] ,高通量细胞筛选的应用更为广泛。

另外,随着荧光成像读板仪(fluorescence image plate reader ,FLIPR) 、定量PCR、高通量荧光激活细胞分类器(HT2FACS) 等检测方法和技术的不断发展和应用,灵敏度和重现性这两个高通量细胞筛选的关键问题也逐步得以解决。

初筛得到的基因通常选用二级分析模型进行功能验证,验证方法可能通量略低,但与功能的相关性更强[15 ] 。

4 、反义核酸技术
反义核酸技术(antisense technology) 主要包括反义RNA ( antisense RNA) 和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) ,可以通过多种机制快速、可预测地调节培养组织或细胞的基因表达,用来快速、有效地测定基因功能[16～18 ] 。

4. 1 RNA 干扰技术
天然反义RNA 广泛存在于原核和真核细胞内, 通过与靶基因形成RNA-RNA 或RNA-DNA 双螺旋, 对基因功能起重要的调节作用。

RNA 干扰技术(RNA interference ,RNAi) 正是利用了反义RNA 与正链RNA 形成双链RNA ,特异性抑制靶基因转录后表达这一原理,成为研究转录后调控的有效工具, 广泛用于功能基因组学、基因治疗和转录调控机制研究[16～18 ] 。

在这一技术中,早期使用双链RNA (double-strand RNA , dsRNA) 作为干扰剂,核心技术是小分子干扰RNA( small interfering RNA , siRNA) 的设计与合成(哺乳动物通常选择21～23 bp dsRNA ,其他生物选择更长的片段) ,另外,还包括siRNA 的标记、转染和RNAi 的检测。

然而,基因敲除实验显示RNAi 存在一定程度的非特异性[19 ] 。

分析认为,RNAi 最初在哺乳动物细胞中所获得的成功,部分是由于所使用的短链dsRNA 激活了胞内dsRNA 依赖的蛋白激酶,引起细胞反应并不断累积[20 ] 。

新近两方面技术的发展使得RNAi 在哺乳动物细胞中更加奏效: (1) 使用能使siRNA 稳定表达的新的载体系统[21 ] ; (2) 利用人U6核内小RNA ( snRNA) 启动子进行单一RNA 转录单位的核内表达[22 ] 。

即通过转染dsRNA 的胞内表达并在胞内降解成约20 bp 的dsRNA ,后者通过RNA依赖的RNA 合成酶复制,并结合
到核酸酶复合物上,形成RNA 诱导的转录沉默复合体(RNA-induced silencing complex ,RISC) ,降解靶mRNA[17 ] 。

4. 2 反义寡核苷酸
反义寡核苷酸主要通过RNase H介导的机制抑制基因表达。

RNase H 是一种降解RNA2DNA 杂交链中RNA 的酶,产生5′-磷酸和3′-OH 端。

RNase H酶切产物因缺少5′-cap 和3′-poly A 尾而被细胞中的5′和3′外切酶降解。

这种高效的方法已被广泛用于含有反义寡核苷酸序列样的靶基因的下调( down regulation) 。

实际上,这种技术对于鉴定mRNA 中的有效靶基因在某种程度上靠经验,因为许多靶基因不能显示最佳活性。

可以通过增加反义寡核苷酸的种类克服这种局限,如在96 孔板上进行PCR 后, 同时使用80 种以上的反义寡核苷酸进行同一个mRNA表达的研究。

整个过程仅用4～5 d。

因此,这是一种高通量的基因功能检定方法[16 ] 。

化学修饰如2′-甲氧基乙基化〔2′- O-(2-methoxy) ethyl ,2′-MOE〕可降低细胞中核酸酶对寡核苷酸的降解作用,因而得到越来越多的研究应用[23 ] 。

反义寡核苷酸技术已被用于多种系统的基因功能研究,如蛋白磷酸化酶、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂p27/ kip (cyclin-dependent kinase inhibitor p27/ kip) 、凋亡蛋白抑制剂survivin 和抗凋亡蛋白BCL-XL[16 ] 。

反义技术广泛用于体内外模型中靶基因功能的验证,可部分替代基因敲除技术。

5、转基因/ 基因敲除技术
应用于基因转染细胞和转基因动物的转基因技术,连同基因敲除技术,已经成为基因功能评价和功能确证的有力手段。

5. 1 基因转染技术
真核细胞的基因转染(gene transfer) 是研究基因功能的有效手段之一。

转染基因包括质粒DNA , RNA 和寡核苷酸。

转染分为瞬时转染(DNA 导入宿主细胞的核中但不整合到染色体中) 和稳定转染(DNA 整合到宿主细胞的染色体中或形成附加体) ,可通过物理(如电穿孔
法) 、化学(如磷酸钙、阳离子脂质体、非脂质体脂类) 和生物学方法(如逆转录病毒等病毒介导的) 进行,常用转染方法见表1。

其中,非脂质体脂类转染试剂,如FuGene 6 , 由于对一些细胞的毒性比一般阳离子脂质体的要小,可提高转染效率和扩大使用细胞的范围,因此在一定
程度上受到欢迎[24 ] 。

转染条件的优化包括培养细胞的密度、核酸量、核酸与转染试剂的比例、转染时间、转染后培养时间等。

影响转染的主要因素有细胞培养物(如细胞代次、培养基、血清等) 、载体大小及形式(超螺旋或线性) 、核酸质量(纯度、内毒素含量) 及转染方法。

基因转染细胞越来越多地用于基因功能的发现和验证,也可用来对目的基因及其表达产物进行细胞内定位研究,以验证该基因是否编码结构蛋白, 或表达分泌蛋白[25 ] 。

表1 常用的转染方法
5. 2 转基因动物/ 基因敲除技术
动物的正常生理依赖于体内不同类型细胞间的相互作用,后者通过细胞通讯和信号转导实现。

由于一个基因功能的实现不仅会对细胞和整体产生作用,同时也会受到来自细胞内外的调控,因此,在正常或病理状态下的整体动物中进行基因功能的评价和确证研究更为有效。

通过对胚胎细胞进行基因工程改造或基因转染所获得的转基因小鼠(transgene mice) 和基因敲除(gene knock-out) 小鼠,为在整体水平上研究基因功能和药物作用靶点提供了极为有效的工具和模型,其技术也日趋成熟[26 ,27 ] 。

6 结语
功能基因的筛选研究对于快速估测和了解新基因的生物学功能,确定该基因是否能够成为药物靶点或直接作为治疗药物(基因药物或蛋白质药物) 具有重要意义。

本文对高通量细胞筛选技术、反义核酸技术、转基因技术等功能基因筛选方法的应用及研究进展进行了综述。

快速、灵敏、高通量、相对特异是对功能基因筛选方法的要求和挑战。

随着功能基因组学研究的广泛开展,上述技术得以不断提高, 一些新的、综合性检测技术和研究方法,如转染细胞芯片技术、单细胞芯片及其检测技术、灵敏的基因表达分析技术等[28～30 ] ,也应发展并得以应用。

这些都大大加速了功能基因的研究进程,也为药物发现带来了机遇。

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