常用DNA操作技术,分子克隆杂交技术,基因表达技术,基因芯片

用溴化乙锭 （ethidiu m bromide, EB）染色 的核酸分 子在紫外 光下发出 荧光，肉 眼能看到 约50ng DNA条带
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Golden view
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限制酶切图谱(DNA物理图谱) 用限制酶消化DNA分子后经凝胶电泳分离，根 据电泳图谱分析确定各种限制酶切位点在 DNA上的相对位置，即可绘制出一幅完整的 限制酶切点图谱。
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Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150nt/S/酶分子 70℃ 60nt/S/酶分子 55℃ 24nt/S/酶分子 Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20~85℃， 高于90℃时合成很难进行。
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PCR反应温度与时间的设置： 予变性 94℃ 5~10min 变性 93～94℃ 1min 退火 40～60℃ 30～60sec 延伸 72℃ 1min 循环 30～40次 末端补平72 ℃ 10min
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1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆 菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热 DNA聚合酶——Taq DNA Polymerase。Taq 酶的特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其 残留活性大于原来的90%。②在热变性时不 会被钝化。③可提高扩增片段特异性和扩增 效率，增加扩增长度(2.0kb)。
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RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism） 原理:RFLP是了解基因细微结构及其变化的一 种方法。如果两个DNA分子完整相同，用同 种限制性内切酶在相同的条件下消化，所得 的限制性内切酶谱相同。如果两个DNA分子 基本相同，只在一处或几处发生某种变异， 就是很小的差异，消化后两DNA分子的限制 性酶谱的条带方式不同，即产生多态性。对 这些条带分析可获得两种DNA分子结构差异 的信息。
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比较G、A+G、 C+T、和C各 个泳道，从测 序凝胶的放射 自显影片上读 出DNA序列。
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8.1.2.3 DNA序列分析自动化
用荧光剂标记DNA引物（或dNTP），被标记 的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照 标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序 反应，跑DNA凝胶后用计算机检测(在凝胶装 置的底部有由激光源和探测器组成的检测系 统)。
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10ul 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L 100ul
PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补 的程度。设计引物应遵循的原则： ①引物长度常为20bp左右。 ②引物扩增跨度200～500bp。 ③引物G+C含量以40～60%为宜，G+C太少扩 增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或 嘧啶核苷酸的成串排列。
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锚定引物序列： 5’-ACGACTCACTATAGGGCT11～12MN-3’ M不为T，N任意，MN共有12种组合方式。 随机引物序列： 5’-ACAATTTCACACAGGACGACTCCAA-3’ 5’-ACAATTTCACACAGGAGCTAGCATG-3’ 5’-ACAATTTCACACAGGAGACCATTGC-3’ 5’-ACAATTTCACACAGGAGCTAGCAGA-3’ 5’-ACAATTTCACACAGGAATGGAAGTC-3’ 5’-ACAATTTCACACAGGATACAACGAG-3’
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凝胶阻滞试验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA） EMSA是利用电泳分析蛋白质与DNA相互作用 的技术。 原理：蛋白质与DNA结合后分子质量将增加， 在电泳中移动的速率减小，没有结合蛋白的 DNA片段迁移速率大。利用这一原理可分离 纯化细胞提取物中特定DNA结合蛋白。
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在EMSA中可用放射性同位素标记的DNA片段 与细胞提取物共温育，在非变性聚丙烯酰胺 凝胶中进行电泳。放射自显影技术显现标记 DNA条带位置。根据位置判断细胞提取物中 是否存在DNA结合蛋白。
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8.1.2 核酸序列分析
测序策略：测定含有靶DNA随机片段的序列， 利用计算机排列每个序列在靶DNA中的位置。
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酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶切位 点，酶切后电泳分离，应获得符合理论的片 段。 分子杂交：检测PCR产物的特异性。 核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可 靠方法。
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随机扩增多态DNA（Randomly Amplified Polymorphic）分析 RAPD是利用PCR技术从扩增的DNA片段上分 析多态性。由于被引物选择地扩增，并不是 所有序列都扩增，扩增了的片段能在凝胶上 清晰地显示出来，这样就可通过同种引物扩 增条带的多态性反映出模板的多态性。
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RFLP也可用来研究基因突变和基因转化。例 如某限制酶对一DNA片段有A、B、C三个 切点，完整消化后电泳出现四条带，若该片 段中有外源基因插入，插入部位没有影响酶 切位点，并且插入的片段中也无该限制酶的 切点，那么谱带数与原来相同，但有的条带 的迁移率将出现差异，即产生多态性；
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在DNA测序反应中，加入模板DNA、引物、 DNA聚合酶（常用Klenow大片段，无5’→3’ 外切酶活性）、dNTP，在4组独立的酶反应 中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4 组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每 一个A、G、C或T的位置上。电泳分离读序。
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④避免引物内部出现二级结构以及两条引物间 互补。 ⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个 碱基应严格配对。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增 的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切 分析或分子克隆很有好处。
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⑦引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显 同源性。每条引物的浓度0.1～1umol或10～ 100pmol，以最低引物量产生所需要的结果 为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性 扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
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RAPD是以PCR技术为基础，利用一系列（通常 数百个）随机引物(通常为10mer)对所研究的 DNA进行PCR扩增，分析扩增片段的多态性， 以反映基因组相应区域的DNA多态性。 因此，基因组在扩增区域发生突变就可能导致 PCR产物的改变。通过检测即可检出基因组 DNA的多态性。 RAPD可在对被检对象无任何分子生物学资料的 情况下进行分析。
若插入位置正好在酶切位点上，则条带减为三 条，度出现迁移率的变化；若插入的外源基 因内有一个该限制酶的切点，且没有影响原 来酶切位点，则条带增为五条，这三种情况 都发生了多态性。 若未发生转化，则条带数目及迁移率与原来相 同，无多态性出现。
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SNP（single nucleotide polymorphism） SNP是在基因组水平上由于单个核苷酸的变异 而产生的一种DNA序列多态性。这种单核苷 酸变异包括单碱基的转换和颠换。
81dna82838485生化教研室文建雷811根据核酸分子大小选择琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作支持物制胶板点样电泳染色照相或扫描生化教研室文建雷生化教研室文建雷用溴化乙锭ethidiubromideeb染色的核酸分子在紫外光下发出荧光肉眼能看到约50ngdna条带生化教研室文建雷goldenview生化教研室文建雷生化教研室文建雷生化教研室文建雷生化教研室文建雷限制酶切图谱dna物理图谱用限制酶消化dna分子后经凝胶电泳分离根据电泳图谱分析确定各种限制酶切位点在dna上的相对位置即可绘制出一幅完整的限制酶切点图谱
动画
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8.1.2.2 化学修饰法
Maxam-Gilbert法利用对DNA化学降解测序。 通过对末端标记的DNA片段在4组独立的化学 反应中分别进行部分降解，其中每一组反应 特异地针对某种或某一类碱基。因此生成4组 放射性标记的分子。每组混合物中均含有从 标记端到降解位点长短不一的DNA分子，其 长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA 全片段上的位置。反应后进行电泳分离放射 自显影来检测末端标记的分子。
8 分子生物学研究方法简介
8.1 常用DNA操作技术 8.2 分子杂交技术 8.3 分子克隆技术 8.4 基因表达研究技术 8.5 基因芯片
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8.1.1 核酸电泳
根据核酸分子大小选择琼脂糖凝 胶或聚丙烯酰胺凝胶作支持物制 胶板→点样→电泳→染色→照相 或扫描
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酶切作图时，先选择某种对DNA分子只有一个 切点的酶进行切割，并以此切点为起点，然 后进行适当组合的双酶切和多酶切，根据各 种酶切所得DNA片段的大小及变化，即可推 测并确定各切点的相对位置。
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对于重组DNA分子，可用识别序列为4个碱基 的限制酶组合进行切割，经电泳测量片段大 小作出精细结构图。 获得限制性图谱的作用：进一步证实转化体中 含有重组DNA分子以及外源DNA片段插入的 特定位置。为重组分子的进一步鉴定提供可 靠的依据。
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8.1.3 聚合酶链式反应及应用
1971年Korana提出核酸体外扩增的设想： “变性DNA与合适的引物杂交，用DNA聚 合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆 tRNA基因”。
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1985年Mullis等发明了聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR)。在试管 中给DNA合成提供：模板DNA，引物，DNA 聚合酶，缓冲体系，DNA变性、复性及延伸 的温度与时间。 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶I的Klenow片段，Klenow酶不耐热， 在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化， 每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期。
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不同月季品种的RAPD（郭立海，2002）
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动画
RT-PCR：mRNA的提取分离、逆转录和扩增
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Differential display
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差异显示分析：mRNA→cDNA(3’端用锚定引 物，5’端用20条随机引物扩增)→酶切→加接 头→
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PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过 程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡 核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基 本反应步骤构成，2~4min一个循环，2~3hr 就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
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标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双蒸水至
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一般1Kb以内的DNA片段延伸1min。3～4kb 的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增 带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间 要稍长些。循环次数越多，非特异性产物的 量亦随之增多。
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PCR产物是否为特异性扩增，必须 进行分析鉴定才能得出结论。 凝胶电泳分析：PCR产物经电泳分 离，产物片段的大小应符合预计 的大小。
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8.1.2.1 双脱氧链终止法
1977年Sanger发明双脱氧链终止法测定单链 DNA的序列。 原理：①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板， 合成准确的DNA互补链；②该酶能够用2’,3’双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生 寡核苷酸链的3’-末端，从而终止其延伸反应。 电泳分离反应产物，读出基因的序列。
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变性梯度凝胶电泳检测SNP：异源DNA双链与 同源DNA双链由于熔解温度Tm值不同，从而 在分子稳定性或单链构象上也不会完全相同， 据此，利用变性剂的浓度梯度凝胶电泳来进 行分离检测。分别具有一种SNP等位基因型 的两种DNA分子之间即使只有一个碱基对的 差异，也会在不同时间发生部分解链，从而 分离成两条带。
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此方法成败的关键取决于降解反应的特异性。 第1步先对特定碱基进行化学修饰，而第2步 修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5’和3’的磷 酸二酯链断裂。
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性加热条件下脱落 ②G+A反应：先用甲酸使N质子化再用哌啶使 嘌呤脱落 ③T+C反应：用肼使嘧啶开环，哌啶除碱基 ④C反应：在NaCl存在时肼只与C反应，不与T 反应，哌啶除碱基，并使磷酸二酯键断裂。