《基因导入》PPT课件

义 第二节 基因导入的技术方法 第三节 外源基因表达的检测
习题
课间
结束
一、基因转移技术的种类
二、受体细胞和基因导入方法的选 择
习题
课间
结束
二、 磷酸钙转染法 三、 脂质体介导转染法 四、 电击法 五、 葡聚糖转染法 六、 细胞显微注射转染法
课间
结束
意义
把外源基因导入细胞中的技术称
基因转移(Gene Transfer)或转基因 技术。其主要意义在于：
鼠红白血癌细胞)细胞中，却能促 MEL—14细胞发生分化。据此，检测 β球蛋白基因时，需用MEL—14而不 用Hela细胞。从而受体细胞的选择 绝不是无关法
和脂质体介导法，均有稳定转染效 应。
转染的DNA附在细胞表面，而后被
细胞吞入，此两种方法适用于贴附 生长细胞的转化。
基因neo或在小鼠细胞中检测某些人 的基因等，都可用PCR进行检测是否 转移成功，此法快速简便。
技术已普遍应用到染色体基因定位，
用生物素或地高辛标记，操作方便， 实验周期短，特异性好。
完整的，所反映的是原来的本质。 因而这一点有别于其它的转移方式。
不足之处是该方法实验程序复杂,
周期长，涉及到的技术多，应注意 所用技术的标准化。
可观察到基因表达现象，但不持久，
随时间推移表达渐减弱或消失。瞬
时表达的机理尚不清楚，可能与被 导入的基因末进行整合有关。
染色体转导
磷酸钙法
染色体注射 电击法
脂质体法
细胞内基因转导
显微注射法
基因转染 逆转录病毒介导法
（体细胞） 其他
基因转导
转基因动物
（生殖细胞）
受体细胞对导入后基因的表达有
很大影响。基因导入后的表达与受 体细胞性状、细胞种类、来源有密 切关系。同一基因导入不同细胞， 可能产生不同表达效果。
养瓶(这种培养瓶的厚度比常规培养
瓶薄，瓶口为垂直而且比较小，生 长面积为25cm2，容积为40m1)。去 掉培养液，加入含有10μg／m1细胞 松弛素B的无血清培养液至瓶口，用 瓶盖盖紧，置37℃温育30分钟；
转子筒内，离心力10 000g，34℃离 心65分钟，离心后细胞沉在瓶下角，
避免震荡，去上清，加入新鲜培养
多，但主要为以下基本部分： ①将选择性标志基因转导供体细胞； ②制备微小细胞； ③微小细胞与受体细胞融合； ④杂交细胞筛选及鉴定。
到染色体基因组中，带有标志基因
的细胞可进行筛选。如含有抗新霉 素基因(neo)的细胞，可在含G418的 培养基中生长；
微核、排核产生微小细胞、纯化微 小细胞。
贴壁细胞、半贴壁细胞及悬浮细
列等，导入受体细胞基因组中的技 术。
基因转导的具体技术方法当前有：
磷酸钙法、脂质体介导法、电击法 和DEAE葡聚糖法等多种。
达(transient 或短期表达)两类。 稳定表达是导入基因已被整合入
受体细胞基因组中，从而能长期进
行表达；对这类表达的检测，需借 助筛选标记(Selected Marker)，才能 测知。
的DNA转移技术，癌基因的始动工
作便是用此法完成的，现虽存在有 多种技术，但本法仍有其应用价值。
[1] 原理：
养细胞环境中，能使外源基因进入 细胞内并整合或掺入(Intergrate)到受
第二节 技术与方法
段一般在50—80kb，因此用DNA转 染法所转导的DNA片段长度受到限 制。另外在DNA转染过程中，片段
过长有可能人为地造成基因的损伤
或异常改变等。因此是否能转移完 整的DNA是一个十分重要的问题。
未受损伤的染色体从一种细胞转导 到另一种细胞。应用这一技术得到 的杂交细胞，是研究基因定位、哺 乳动物基因结构、表达、调控的理 想模型。
液，用吸管将细胞沉淀混匀后置冰 上备用；
素B，终浓度10μg／m1的DMEM，将 细胞悬浮在梯度离心液中，37℃育 温30分钟，置Sorvall SS—34角头转 子，23500g，34℃离心65分钟，停 转时勿用刹车。
用吸管小心将中间一条带吸出，
置入50m1离心管中，然后加入等体 积无血清培养液，3000转离心10分
1）检测基因的性状和功能。 2）产生特殊细胞组分或蛋白。 3）遗传病的诊断与治疗（动物 模型）。
4）病变或癌变机理研究。 5）动物优良品种的培育（转基 因动物）。
细胞融合或显微注射法把携有目的
基因的染色体或染色体片段导入受 体细胞(或称宿主细胞)内的技术。而 基因转导（Gene transduction）或转 染（transfection）是把已克隆的基 因、含有目的基因的DNA片段或序
钟弃去上清，将微小细胞沉淀悬浮 在无血清培养液中置冰上备用。
培养液稀释至120m1，依次通过 12μm、8μm、5μm和3μm的微孔滤
器，过滤时尽量避免用力，以防较 大的细胞核或完整细胞核穿过滤膜；
细胞，将其悬浮在6m1无血清培养液 中，置冰上备用。
每次实验取十分之一体积的微小
细胞悬液制备细胞滴片，用Giemsa 染色观察微小细胞的形态。
胞都可用以下方法诱导产生微核。
培养至80％一90％汇合，加秋水仙 胺0.02——0.1μg／m1，培养24小时， 收集分裂中期细胞；
将细胞悬浮在低渗培养液中，置 37℃作用10——30分钟，时间因细
胞不同而异。对大多数不易形成微 核的细胞均可用此法；
用常规培养液(不含秋水仙胺)培养过 夜；
(4)经上述诱导产生的微核细胞， 可用Giemsa染色后或不染色在相差 显微镜下观察。
胞，无论是具有形态转化的，还是 G418抗性的，最后确定染色体转移
是否成功，应确定有无外源性染色
体转移，除核型分析外，可用下列 方法：
备染色体标本、室温下老化一天，
用三蒸水浸泡(37℃)过夜，用6％ Giemsa溶液，pH 11.3，做分化性染 色3分钟，水洗、镜下观察。可根据 着色深浅判定结果。
用无血清培养液洗一遍以去掉血清，
加入1m1 微小细胞悬液，置37℃培 养20分钟，待微小细胞与受体细胞 粘在一起后，去掉培养液，加44％ PEG处理40—60秒，用无血清培养液 洗3遍，加常规培养液置37℃培养。
(2)融合细胞筛选： 融合后的细胞培养24小时，以1： 3分瓶传代，培养24—48小时后加 入选择培养基，如含G418的培养 液，每隔3—5天换液一次，筛选 2—3周。