ELISA方法在基础医学研究中的应用

ELISA方法在基础医学研究中的应用
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1. ELISA的基本原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种具有高特异性和高敏感性的实验技术，几乎所有的可溶性抗原一抗体系统均可用以检测，它的最小可测值达ng甚至pg水平。

该方法的基本原理如下：(1)将抗原或抗体结合到某种固相载体(目前以聚苯乙烯微量滴定板最为常用)表面，并保持其免疫活性。

此步骤称为“固相载体的包被”，在商品化试剂盒中均已完成。

(2)再将抗原或抗体与某种酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)连接成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

检测时，按相应顺序加入待检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或酶标抗体，使其与固相载体上的抗原或抗体发生反应。

以洗涤的方法洗去各步骤中过量的未结合物质，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

(3)最后加入酶反应的底物，底物即被酶催化生成有色产物，而有色产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定量分析。

此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

2. ELISA技术在临床医学研究中的应用ELISA步骤复杂，试剂制备困难，只有应用符合要求的试剂和标准化的操作，才能获得满意的结果。

目前应用较广的检测项目一般均有试剂盒出售，完整的ELISA试剂盒应包含已包被好的固相载体、酶结合物、底物和各种浓缩的稀释液、缓冲液等。

在医学研究中，ELISA试剂检测的项目主要可分为以下几类：(1)各种病原体及其抗体的检测：如肝炎病毒、巨细胞病毒、风疹病毒、疱疹病毒、艾滋病病毒等；(2)蛋白质：肿瘤标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原等；激素如HCG、FSH、TSH等；细胞因子如TNF．0l、VEGF、NFKB等；载脂蛋白如Apo A—I、ApoE等；(3)非肽类激素：如T3、rr4、雌二醇、皮质醇等；(4)检测血液中的药物浓度：如治疗心脏病的药物地高辛、抗癫痫药物茶碱、抗生素庆大霉素等。

用于基础研究的标本来源多种多样，如临床血液标本，实验动物的血液标本，实验动物的组织标本，培养的细胞以及细胞培养上清等，均可作为待测样本用于检测其中某种物质的含量。

具体应选取何种样本进行特定指标的检测，取决于实验研究的目的以及待测物质的表达特性。

3. ELISA在基础医学研究中的应用特点ELISA方法在基础研究中的应用与其在临床检验工作中具有很大不同，区别之处主要如下：(1)基础研究中ELISA检测所用标本来源广泛，涉及人、大鼠、小鼠、兔、猪、犬等多种常用实验动物种属的血液、组织、细胞及细胞培养上清液等，而临床检验所用标本则以人的血液(血清或血浆)和尿液等为主；(2)基础研究具有探索性，其结果也具有不确定性，没有正常值范围而言，需要根据ELISA检测指标的具体数值判断不同实验组间样品测定值的意义；而临床检验的ELISA检测结果具有阳性或阴性的界定，或者存在正常值范围作为判读测定结果的标准。

(3)对于临床检验标本如血清和血浆而言，各种指标的ELISA检测试剂盒均会给出对待测样品的最佳稀释倍数；而在基础研究中，尤其当所测指标是在组织中表达时，即待测样品来源于组织时，ELISA检测试剂盒通常不会推荐对待测样品的稀释倍数；此时，研究者必须先通过预实验摸索出一个最佳稀释倍数之后再进行检测，因此，对组织样本的检测步骤较为复杂和繁琐。

4. ELISA的分类及主要操作流程ELISA方法既可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

根据样本中待测物质的种类及性质不同，可以设计出各种不同类型的检测方法。

临床检验工作中用到的ELISA方法主要分为以下几种类型：(1)用于检测抗原的：双抗体夹心法和竞争法；(2)用于检测抗体的：双抗原夹心法、间接法、竞争法及捕获包被法等。

然而，在基础医学研究中，涉及到的检测指标大多数为抗原性物质，因此，下文仅就双抗体夹心法和竞争法这两种测定抗原性物质的方法进行详细说明。

4．1 双抗体夹心法检测抗原研究表明，充血性心力衰竭患者循环及组织中自介素一6(inter—leukin-6，IL-6)升高，持续过度的IL-6产生会破坏细胞因子网络并可能导致心肌损伤及功能障碍的进展，因此，循环IL-6水平与左室功能障碍的严重程度密切相关。

在此，以检测大鼠血浆IL-6为例说明双抗体夹心法的ELISA操作步骤和要点。

4．1．1 操作流程(1)取出试剂盒，置室温平衡30min；(2)按照说明书要求配制各种工作液：洗液、标准品稀释液及样品稀释液等；(3)根据说明书推荐的样品稀释度对待测样品进行稀释，同时按照说明书要求配制各浓度的标准品(从空白对照至低浓度一直到高浓度共设8个浓度梯度)；(4)加标准品和样品：分别在标准品孔和样品孔加入标准品和样品各50 L ／孔，贴上封板膜，室温孵育2h；(5)洗板：弃去孔内液体，在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，每孔加洗液3001~L，每次浸泡1 min，共如此重复洗4次；(6)加酶标记的抗体：每孔加酶标记抗体100IzL，室温孵育2h；在此孵育等待期间打开酶标仪，预先建立相应的检测程序；(7)洗板：重复(5)中的步骤；(8)加酶的底物：每孔加lOOp,L酶底物溶液，室温避光孵育30 min(30 min内，肉眼观察可见标准品孔从低浓度至高浓度的淡蓝色逐渐加深，至高浓度的34孔呈现明显的梯度蓝色，而低浓度的3～4孔梯度不明显时，即可终止)；(9)终止反应：每孔加100mL终止液，此时蓝色立即转为黄色；(10)读数：加终止液后10—15rain 以内在酶标仪的450nm波长测量各孔的光密度值(使用步骤(6)中预先建立的检测程序)。

4．1．2 双抗体夹心法检测大鼠血浆IL-6的标准曲线在多功能酶标仪(所用仪器：TECAN，GENios plus)中的检测程序设定步骤中，可以详细设定标准曲线上各点的浓度数值和样品的稀释倍数，因此，在最终输出检测数据时，程序软件能够根据标准曲线上各点的OD值及其对应的浓度，将样品的OD值自动转换计算出相应的浓度，检测便捷、直观且结果准确。

4．2 竞争法检测抗原性物质竞争法检测抗原的步骤与双抗体法大致相似，不同之处如下：双抗体夹心法检测抗原时，先加入待检样品使之与固相载体上包被的抗体进行反应，完成特异性结合反应后洗去未结合的抗原，然后加入酶标记的第二抗体，使之与固相载体上的抗原继续反应形成夹心式复合物，对该夹心复合物上的标记物进行测定，即可得到待测样品中抗原的含量；而在竞争法检测抗原的过程中，是将待检样品和一定量的标记抗原同时加入，使二者与固相载体表面有限的抗体进行竞争反应，反应一段时间后洗去游离的抗原，由于竞争反应的结果，使结合在固相载体上的标记物的量与样品中抗原的量成反比，由此可测定样品中抗原的含量。

Apo A—I占高密度脂蛋白(HDL)的67％，能促进高密度脂蛋白的成熟。

4．3 双抗体夹心法与竞争法检测抗原的主要区别(1)双抗体夹心法适用于检测蛋白质等大分子抗原，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶标记抗体。

而小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，不能形成两位点夹心，故通常选择竞争法模式检测。

(2)标准曲线的特点不同。

在双抗体夹心法中，结合在固相载体上的酶量与标本中受检抗原(或抗体)的量成正比，因此，样品的吸光度值(OD值)与浓度呈正比，标准曲线如图3所示。

然而，在竞争法中，标本中的抗原和一定量的酶标抗原与固相抗体竞争结合，也就是说，标本中抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。

因此，样品的吸光度值(OD值)与浓度呈反比。

5. ELISA试验的注意事项
5．1 如何订购试剂盒目前用于基础研究的EL1SA试剂盒有别于临床检验所用试剂盒，不可用于医学诊断，而仅能用于研究。

当确定了待测指标后，需要根据样本的种属来源购买相应种类的试剂盒。

然后，根据待测样品数量计算所需试剂盒的数量。

以最为常用的96孔酶标板为例，每块板均需做标准曲线，一般情况标准曲线设6至8个不同的浓度值，若按照8个点计算，每个样品均需做复孔，则每块板可以检测的样品数量最多为40个。

用待测样品数量除以40即是所需购买试剂盒的数量。

在订购ELISA试剂盒之前还要注意一点：某些试剂盒说明书中要求样品的前期处理必须使用同一公司生产的特定配套试剂，因此，如果测定组织中某个指标的含量时，需要用到相应的组织蛋白提取试剂及蛋白浓度检测试剂，这种情况下，应尽量按照说明书要求提前将所有相关试剂购买完全，以免延误实验。

5．2试剂盒在使用前需要先从冰箱中取出，在室温平衡30min左右再用于检测。

5．3 标本的采集与保存采集血清样品时，需将全血标本于室温放置2h或4℃过夜后，离心分离出上清即可检测，或将上清置于_20~C或以下保存以备用。

为避免反复冻融导致血清中待测物质降解，需适量分装血清后再冻存。

若需用血浆样品进行ELISA检测，则可将抗凝剂(如EDTA、肝素或枸橼酸钠等)加入血液标本，在30min内离心分离上清检测或分装冻存备用。

对于细胞培养上清，需要在1000rpm离心5min，取上清用于检测，目的是为了去除混悬在其中的漂浮细胞。

进行ELISA测定之前，需要按照相应说明书要求，对样品进行稀释之后用于检测。

5．4 样品的稀释倍数当待测样品为血清或血浆时，ELISA检测试剂说明书通常会给出建议的稀释倍数，便于操作。

较为复杂和繁琐的情况是检测组织样本中某种物质的定量表达。

任何ELISA试剂说明书都不会说明一个关键的问题，那就是：从组织样本中提取蛋白之后，以多大倍数对样品进行稀释后最适宜检测?
因为待测物质在不同组织中的表达丰度可能不一样；同时，对于不同的研究者而言，即便用同种组织进行检测，如果对组织的匀浆或裂解的程度不同的话，所提取的蛋白浓度自然就不相同，因此，对样品的稀释倍数就会存在差异。

这种情况下，研究者必须首先提取组织蛋白上清，并测定出蛋白浓度，然后结合文献所报道的待测物质在该组织中的浓度值(一般为每克组织蛋白中所含待测物质的质量)，对蛋白上清的稀释倍数进行估算。

然后在此估算的稀释倍数基础上，还需要以该稀释倍数为中心，另设2—3个稀释度，通过预实验摸索出最佳稀释倍数，最后再进行正式实验。

5．5 抗凝剂的选择对于某些特殊的检测指标，为了使测定结果准确可靠，需要了解相关的知识。

例如，用血浆样品进行脂蛋白分析时，需要注意抗凝剂的选择。

由于枸橼酸钠和氟化钠等低分子量抗凝剂的低渗效应，使得大量水分子进入血浆造成血浆成分的稀释。

而二价阳离子螯合剂EDTA，因其分子量较大，产生的低渗效应小，对血浆蛋白浓度影响很小，仅降低3％或4％；肝素比EDTA的分子量更大，其在产生抗凝作用的浓度时未检测到对血浆的稀释效应。

因此，EDTA和肝素均可用作脂蛋白分析研究的抗凝剂；同时，由于EDTA 能抑制在血浆冻存过程中发生的氧化反应和酶组分的改变，故在实际操作中ED—TA是最常用的抗凝剂。

用于基础研究的ELISA试剂盒，在说明书中一般都会推荐该检测指标需使用的抗凝剂，取血液标本之前要注意查看。

5．6 其他需要准备的仪器及耗材除了酶标仪之外，还用到的仪器有酶标板专用控温摇床、37~C孵箱和漩涡混匀器等，需根据不同试剂盒操作要求而选择使用。

此外，各个量程的移液器、一次性吸头、吸水纸、乳胶手套、烧杯和量筒、去离子水、冰盒、试管及离心管等。

在检测开始之前应准备好以上所有物品放置于手边，以使检测过程顺利进行。

5．7 ELISA操作要点在ELISA操作中有以下几个步骤较为关键：(1)加样：加样要准确，试剂应垂直滴加，不得倾斜、人为的加大试剂量。

使用一次性吸头，防止交叉污染。

定期校准加样器。

标本应加在微孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不要溅出及产生气泡。

(2)温育：96孔酶标板结构特别，易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围孔与内部孔的升降温速率不同，造成周边与内部孔结果有差异。

因此，温育过程中应该用封板膜封闭整块板，尽量避免边缘效应的产生。

温箱温度必须严格控制，温育时间也应按说明书规定力求准确。

(3)洗板：冼涤是ELISA操作的重要环节，手洗条件一致性较差，对结果影响较大，半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果。

洗涤时确认洗液注满每个板孔，但不可溢出板孔，弃液后将孔内液体在吸水纸上拍干。

为了洗涤效果更好，实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法，在机器洗涤后再进行人工洗板1-2次，或适当增加洗板的次数。

(4)显色终止：显色时间应严格按说明书的规定。

应在显色终止15min内进行酶标仪读取。

5．8 使用全自动多功能酶标仪建立检测程序针对具体检测指标而言，使用酶标仪及其相关软件设置标准品的浓度、样品的数量、样品的稀释倍数、样品的排布及数据输出格式等条件，在显色反应终止之前预先建立好检测程序。

待显色终止后，即可将反应板放置于酶标仪中，打开检测程序进行读数，接着可通过连接的打印机立即打印结果，操作简便、快捷。

综上所述，尽管ELISA法操作简便，但影响测定结果的因素较多，因此，在实际操作过程中，需要加强质量管理，严格按试剂盒说明书进行实验操作。

全自动酶标仪的应用，可实现ELISA标准化检测，以避免或减少相关因素的影响，力求结果准确，为医学科学研究提供可靠的依据。