《基因的定点突变》ppt课件

1988年，ein初次将其用于植物转基因研讨，抑制了当时农杆菌介导
的转基因方法的受体种类和基因型的限制，开创了植物转基因方法的 新领域。McCabeetal利用基因枪法转化大豆幼胚和成熟胚的下胚轴获 得了转基因再生植株。
1990年，From示etal利用基因枪法胜利转化T玉米胚性愈伤组织。同 年Fine:andMcmullen(1990)用陆地棉柯字310的胚性悬浮系进展的基因 枪转化。获得了10个再生植株，较农杆菌介导的遗传转化，所用的再 生时间较短(5个月)。其后，MeCabeandM inell报道T基因型独立的基 因枪转化方法。
基因的定点突变
基因定点突变
• 一、定点突变的开展史 • 二、定点突变的目的 • 三、定点突变的原理 • 四、体外定点突变的方法 • 五、定点突变的方法改良 • 六、定位突变用途 • 七、运用前景
一、定点突变的开展史
1983年，世界上第一株转基因植株(zambryski，1983)的获得标 志着植物转基因时代的到来。 1984年，Paszkowski将NP皿I等嵌合基因克隆到E.coh质粒上，并 用PEG转化烟草获得胜利。 1985年，Horsch等创建了农杆菌介导的叶盘法转基因系统，大 大简化了以往利用原生质体为受体的转基因体系，具有里程碑 的意义。 1987年，Frommetal转化CAT基因，获得胜利。1987年， Jcffersontal利用GUS作为报告基因，使转基因愈伤组织和植株 检测变为方便快速，大大的提高转基因效率。1987年，美国康 耐尔大学的Sanford等发明了基因枪。
七、运用前景
• 不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，经过改动PCR条件提 高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变〔saturation mutagenesis〕。 不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出 现一个位点2个以上碱基突变，因此运用上有局限性。定点突变 适用于蛋白构造已有初步了解的基因，比PCR随机突变卦有目的 性，也更为准确，简单，同时改造基因更加“随心所欲〞。由于 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的运用前景，置信这 个技术在不远的未来还会有更大的改良和开展，也必将为更多人 熟习运用。
• 有的时候研讨能够需求多个位点的定点突变，比如改造酶的活性或 者动力学特性，研讨蛋白之间的相互作用位点等，单点突变不能满
足实验的需求，反复进展单点突变也非常浪费时间。因此 Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。最多一次实验可以引入5个定点突变。这个试剂盒的原理和 Clontech的类似，就是预备多个带突变的引物〔同方向，对同一单 链模版〕，退火后全部突变引物〔不超越5个〕都结合在同一环状 单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停顿，各片断 经衔接成环，和单链模版组成杂和环，DpnI消化双链模版，也消化 杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环〔mutant ssDNA〕，得以转化E.coli，构成双链质粒。
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五、定点突变的方法改良
• 设计一对包含突变位点的引物〔正、反向〕，和模版质粒退火后用 PfuTurbo聚合酶“循环延伸〞，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模 版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延 伸的循环，这个反响区别于滚环扩增，不会构成多个串联拷贝。) 正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶 切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam 甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎〔DpnI识别序列为甲基化的 GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次〕，而体 外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随 后的转化中得以胜利转化，即可得到突蜕变粒的克隆。这个试剂盒 非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突蜕变粒对 DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突蜕变粒，使得操 作简单有效。
三、定点突变的原理
• 定点突变是指经过聚合酶链式反响〔PCR〕等方法向目的DNA 片段〔可以是基因组，也可以是质粒〕中引入所需变化〔通 常是表征有利方向的变化〕，包括碱基的添加、删除、点突 变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白 的性状及表征，是基因研讨任务中一种非常有用的手段。
四、体外定点突变的方法
六、定位突变用途
• 定点突变法的运用不仅广泛用于基因工程技术领域，还可 用于农业培育抗虫、抗病的良种，用于医学矫正遗传病、 治疗癌症等病。
• 定点突变技术的潜在运用领域很广，比如研讨蛋白质相互 作用位点的构造、改造酶的不同活性或者动力学特性，改 造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白 的抗原性或者是稳定性、活性、研讨蛋白的晶体构造，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
• 目前采用重组PCR进展定位诱变，可以在DNA片段的恣意 部位产生定位突变。
〔3〕盒式突变
• 1985年Wells提出的一种基因修饰技术—盒式突变。
• 盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取 代野生型基因中的相应序列。
• 然而，并非一切变异区附近都能找到适宜的限制位点，假 设不存在限制位点，就要用寡核苷酸指点的定位诱变引入 限制位点。
1994年，Hieital经过运用农杆菌侵染诱导剂乙酞丁香酮(AS)以及构建 巧rG和巧rB高效表达的超双元载体，高效胜利地转化了水稻。利用该 转基因系统，Ishidaetal(1996)、Tingayetal(1997)和Chengetal(1997)相继 获得了玉米、大麦和小麦的转基因植株。
二、定点突变的目的
•〔1〕寡核苷酸介导的定点突变 •〔2〕PCR介导的定点突变 •〔3〕盒式突变
〔1〕寡核苷酸介导的定点突变
•寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 的生物化学家( michael smith )发明 的.
寡核苷酸定点突变根本原理
• 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因 完全互补。
• 合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。 • 然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制
在分子生物学和基因工程中的运用
探明未知序列的构造和功能的关系，如启动子诱变挑选，真 核的TATA盒保守序列确定。 载体构建：调控元件，强启动子，多接头。 研讨基因调控序列，如AUG前参与ACC序列最正确。
在蛋白质工程中的运用
降低毒性，如TNF 改动亚型和种的特异性，如IFN的23位AAG〔赖氨酸〕，AGG 〔精氨酸〕，使IFN2a变成IFN2b。123位Try〔酪〕变甘/丝， 使IFN种属特异性明显改动，对人抗病毒活性小于牛。 提高活性和稳定性，如IFN- βser17〔cys变ser〕 提高蛋白质作用的专注性，如IFNβ的9-56位被IFNa的7-54位 取代后，活性提高40倍。
• 资料阐明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为 30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定 点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有1—2个不同定点突 变的质粒〔由于存在1—Hale Waihona Puke 个引物结合模版延伸构成单链环的能够〕
。这样，一次实验可以得到不同数目突变的质粒，对于研讨蛋白质 构造和功能的关系也是有用的。
• 基因定点的突变是指按照设计的要求，使基因的特定序列发生 插入、删除、置换和重排等变异。
• 体外定点突变技术是研讨蛋白质构造和功能之间关系的有力工 具。
• 蛋白质的构造决议其功能，对某个知基因的特定碱基进展定点 改动，缺失或者插入，可以改动对应的氨基酸序列和蛋白质构 造和功能，改造酶的不同活性或者动力学特性。
。 • 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变
型子代链。 • 将获得的双联分子经过转导入宿主细胞，并挑选出突变体其中
基因已被定向修正
〔2〕PCR介导的定点突变
• 在最初所建立的PCR方法中就可看出只需引物带有错配碱 基便可使PCR产物的末端引入突变。但是诱变部分并不总 在DNA的中间部分进展诱变。