生物化学实验-氨基移换反应及其产物的鉴定

⑻ 电吹风:1把/每组（2人）；
⑼ 滴管；
⑽ 康氏皿（1套/每人）；
⑾ 喷雾器（4-6个/每班）；
⑿ 烘箱（80 ℃）1台；
⒀ 一次性手套。吸水纸、两层纱布/人
丁鸣
五.实验操作方法和步骤
1.转氨酶液的制备 取新鲜动物肝脏约3g/组（2人），将肝剪碎放入研钵或匀浆器中，加3ml磷酸
缓冲液迅速碾磨（匀浆），再加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集滤液 即得转氨酶提取液备用。 2.氨基移换反应
2cm
5.5cm
1cm
3cm
用铅笔作出点样位置
用铅笔尖在圆心处截一小孔
“灯芯”制作
⑵ 点样：用毛细管依次点标准α-丙氨酸(Ala)、 谷氨酸(Glu)各点2次，其 余1－4号管样液各点2～3次。点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风 吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm。
1
2
3
6
2
5
4
1——1号管反应样液 2——2号管反应样液 3——3号管反应样液 4——4号管反应样液 5——标准样液：α-丙氨酸 6——标准样液：谷氨酸
⑻ 显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。
四.实验器材与仪器
⑴ 研钵或匀浆器:1套/每组（2人）；
⑵ 试管及试管架:1套/每组（2人）；
⑶ 恒温水浴箱（37℃、100℃）；
⑷ 铅笔、尺和圆规（学生自备）；
⑸ 毛细管（直径0.5mm)；
⑹ 新华定性滤纸（直径11cm）；
⑺ பைடு நூலகம்刀和镊子:各1把/每组（2人）；
丁鸣
溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：
原点到层析斑点中心的距离
R 值
f
原点到溶剂前缘的距离
Rf
X Y
X——原点到层析斑点中心距离 Y——原点到溶剂前沿的距离
Y X
溶剂前沿
⊙
样品层析斑点
●
原点
在一定的条件下某种物质的Rf 值是常数。Rf值的大小与样品的性质、结构、 溶剂系统（溶剂的性质、溶剂的pH）、层析的温度和层析滤纸有关。此外， 样品中的盐分，其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。
2.纸层析原理：
滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不 相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。
层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附 一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分 离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进 行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶 于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分 离。
丁鸣
实验七 氨基移换反应及其产物的鉴定
丁鸣
一.实验目的和要求
1.学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；
2.学习纸层析的原理和操作技术。
二.实验基本原理
1.氨基移换反应： 在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发
生的互换反应。 转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催
化。转氨酶的最适pH接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转 氨酶（GOT）的活性最强。
转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶 （glutamic pyruvic transaminase, GPT）、谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase,GOT）活性较高。
取4支洁净、干燥的试管，按表1操作表1
管号 作 转氨酶提取液 0.25%碘乙酸
预温
试剂、操
（ml） （ml）
0. 1mol/L α－丙氨酸 pH8.0（ml） 0. 1mol/L α－酮戊二酸 pH8.0（ml） 0.01mol/L 磷酸缓冲液 pH8.0 （ml） 酶促反应 终止酶反应
1
2
3
4
1
1
用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的R基团的化学结构或极 性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（ 0.01mol/L pH7.4磷酸缓 冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛 细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸 样品的分离图谱。
1
1
0.5
0.5
0.5
0.5
滴加10％三氯乙酸溶液2滴， 100℃水浴保温5min
置37℃水浴保温5min
1
1
1
1
1
1
1
2
2
1
混匀，置37℃水浴保温40min（经常摇动）
滴加10％三氯乙酸溶液2滴，置 100℃水浴保温5min
3.层析
⑴ 准备： ①取新华定性滤纸（直径11cm）一张，找出圆心，用圆规画一直径2 cm的细 圆圈（保持干净），并按图1用铅笔作出点样位置。找出圆心，用铅笔尖在 圆心处截一小孔（孔径约0.2cm)，戴一次性手套操作，以免污染滤纸。 ②另取2cm×3cm滤纸，先将下端剪成须状，卷成“灯芯”，备用。
丁鸣
点样处
点样
（可将滤纸放在康氏皿的盖子上操作）
2 1
6
3 4
5
⑶ 展层、显色
将下端剪成须状,卷成的“灯芯”，然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔中, 平放在盛有展层溶剂的康氏皿中,使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中,再在滤纸 上盖上另一康氏皿（图1）。展层剂沿灯芯上升到滤纸,再向四周扩散,待溶剂前 沿距康氏皿外槽内缘0.5cm(约需半小时)，取出滤纸，用镊子拔出灯芯，滤纸用 电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮－乙醇溶液，用电吹风热 风吹干或放入烘箱（80℃）中显色3min。
3.茚三酮的显色原理：
氨基酸+茚三酮类
紫红色复合物
80℃
丁鸣
三、实验材料与试剂
1.实验材料 动物肝脏约3g/2人一组 2.实验试剂 ⑴ 0.01mol/L磷酸缓冲液(pH8.0):（转氨基反应所需缓冲溶液）； ⑵ 0.1mol/L α-丙氨酸(pH8.0):（转氨基反应的底物,纸层析的标准样品）； ⑶ 0.1mol/L α-酮戊二酸(pH8.0)（转氨基反应的底物）； ⑷ 0.1mol/L谷氨酸(pH8.0)（纸层析的标准样品）； ⑸ 展层溶剂: （纸层析用）； ⑹ 10％三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）； ⑺ 0.25%碘乙酸（抑制L-谷氨酸脱氢酶活性）；
GPT催化下的转氨基反应：
L－谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L －谷氨酸氧化脱－NH2，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反 应的产物L－谷氨酸。
本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和α—酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶 （GPT) 的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。