工具酶的发现和基因工程的诞生emma

G
T
A
G
T
•结果：具有相同黏性末端的两个DNA片段连接起来，形成
重组DNA分子。
•注意： •限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键，
只是一个是切开，一个是连接 •氢键的断裂与形成与限制酶、DNA连接酶无关。
G C G A A T T C C C
A T G A A T T C A A
C G C T T A A G G G
转基因鱼
三文鱼原是西餐和日本料理的主 要原料，不仅味道鲜美，而且富含 有益心血管健康的奥米伽-3脂肪酸。 三文鱼种类不少，在国内市场上最 常见的是大西洋鲑，野生的大西洋 鲑因为过度捕捞，已濒临灭绝，市 场上卖的大西洋鲑99％以上是人工 养殖的。 大西洋鲑的生长速度缓慢，第一 年体重只增加20～30克，一般要 养三年才能上市。因此可以给大西 洋鲑转入体型最大的三文鱼——大 鳞大麻哈鱼的生长激素基因。
5、下图是将人的生长激素基因导入B细胞内制造“工程菌”示 意图，所用载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不 含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表 达。请回答下列问题： (1)若把通过鉴定证明导入了 普通质粒A或重组质粒的细菌 放在含有氨苄青霉素的培养 基上培养，会发生的现象是： 有的能生长,有的不能生长 其原理是： 普通质粒含氨苄青霉素基因； 重组质粒氨苄青霉素基因被 破坏。 (2)导入B细胞中的目的基因成 功表达的标志是： 能合成人的生长激素
质 粒
•来源：细菌及酵母菌等。最常用
的是大肠杆菌的质粒。
•本质：染色体外的小型双链
环状DNA分子。
•特点： •能自我复制；
•常具有抗生素抗性 基因(标记基因)； •其存在对宿主细胞 无影响。 要想将某个特定基因与 思考：质粒上存在的标记基因 有什么用途？ 可以检测 质粒相连，需要用几种限 制性核酸内切酶处理？ 同1种或同两种 质粒是否导入了受体细胞
练习1、下图表示一项重要的生物技术，对图中物
质a、b、c、d的描述，判断正误
A．a通常存在于细菌体内，目前尚未发现真核生物体内有 类似的结构 × B．b识别特定的核苷酸序列，并将A与T之间的氢键切开× C．c连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对 ×
抗生素 抗性基 因 SmaI
BamH I
基因工程的基本工具
一、限制性核酸内切酶 — “分子手术刀”（简称限制 酶） 能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列 的酶 。
1、来源：最初从原核生物中分离，后来在酵母菌中
也有发现(针对外来DNA，保护自身免受外源 2、种类：DNA入侵) 4000种，常用200多种。
3、作用： DNA特定的核苷酸序列进行识别和切割 对
G3
CT G3 T A A5
CTTAA 5 AATTC G
有关DNA酶
•DNA水解酶： 将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水
解时生成磷酸、脱氧核糖和含氮碱基。
•DNA解旋酶： 使DNA解旋成单链，作用部位是碱基与
碱基之间的氢键。（在适当的高温、重 金属盐的作用下，也可使DNA解旋）
Hind III
质粒
1. 图中的质粒和 外源DNA构建重组 质粒,能不能使用 EcoR I SmaI切割?为什么?
2.若将图中的目的基因插入 载体,需要用哪一种限制酶 同时切割载体和目的基因?
EcoR I 目的基因 EcoR I
BamH I
Sma I
Hind III
3.与只使用EcoRI相比较, 使用BamHI和HindⅢ两种 限制酶同时处理质粒、 外源DNA的优点是什么？
限制酶可辨识并切割 DNA 分子上特定的核苷酸序列。下 图为四种限制酶 BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ及 BglⅡ的辨识序 列及每一种限制酶的特定切割部位。 BamHⅠ EcoRⅠ HindⅢ BglⅡ ↓ ↓ ↓ ↓ GGATCC GAATTC AAGCTT AGATCT CCTAGG CTTAAG TTCGAA TCTAGA ↑ ↑ ↑ ↑ 其中哪两种限制酶切割出来的 DNA 片段末端可以互补结合， 其末端互补序列是?
练习：
3、人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基 因，该抗性基因的主要作用是 A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B.有利于对目的基因是否导入受体细胞进行检测 C.增加质粒分子的分子量 【答案：B】 D.便于与外源基因连接 4、基因工程又叫重组DNA技术。假设以大肠杆菌质粒作为 基因载体，并以同一种限制性核酸内切酶切割载体与目的基因， 将切割后的载体与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。 3 连接产物至少有 种环状DNA分子(假设两两结合)，它们 分别是： 运载体与运载体相连、目的基因与目的基因 相连、运载体与目的基因相连
产生我们需要的基因产物，或者让它获得新的遗传性状。
操作环境： 生物体外
操作对象： 基因 操作水平： 分子水平
基本过程：剪切 → 拼接 → 导入 → 表达
基本原理：
基因重组 （不产生新基因，产生
新物种吗？） 工程结果：产生人类需要的基因产物 操作目的：让目的基因在宿主细胞中稳定高效地表达
从此大西洋鲑的身上得到了世界上从没有过的基因？
把生物的遗传物质DNA分离出来，在生物体外，通
过对DNA分子进行剪切、拼接，对生物的基因进行改
造和重组，然后将重组的DNA（基因）导入适当的受 体细胞内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人 类所需的基因产物（蛋白质、多肽、酶等）。
其核心是构建重组DNA分子
广义：把一种生物的基因转入另一种生物体中，使其
T A C T T A A G T T
EcoRI EcoRI 用同一种限制酶来切割两种来源不同的DNA， 会产生相同的黏性末端。
G C G A A T T C C C
G G G
A T G
A A T T C A A
G T T
C G C T T A A
T A C T T A A
G C G A A T T C A A C G C T T A A G T T
1、只使用EcoRI
AATTC G …… …… G CTTAA
2、使用BamHI和HindⅢ
GATCC …… A
G
……
TTCGA
用两种限制酶防止目的基因与载体的自身环化。
5 AATTC
CTA
G CTTAA
载体
使用两种限制酶，防止载体与目的基因反向连接
……
3 G
……
5 A A T 3G TC
ATC …… 目的 基因 GAT …… TAG 目的 基因
限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性 内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的 一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。 ①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。
②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。
③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的 黏性末端能否连接起来？为什么？ 能。因为由两种限制性切割后所形成的粘性末端是相同的。
练习：
1、科学家们经过多年努力，创立了一种新兴生物技术—— 基因工程，实施该工程的最终目的是 A. 定向提取生物体的DNA分子 B. 定向地对DNA分子进行“剪切” C. 在生物体外对DNA分子进行改造 D. 定向地改造生物的遗传性状 【答案：D】 2、以下说法正确的是 A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点， 以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来 【答案：C】
载体扩增
思考：
假如外源基因导入受体细胞后不能复制会怎样？ 会在细胞增殖中丢失 作为载体如果没有限制酶切割位点将怎样？
外源的基因不可能插入 外源基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？ 如果载体上有遗传标记基因，就可通过标记基因 的表达来检测。 如果载体对受体细胞有害将怎样？ 将影响受体细胞新陈代谢，进而使转入的外源基 因也可能无法表达。
回文 序列
专一性--识别特定的序列、有特定的切点
•作用结果：
平末端：平切

粘性末端：错切
下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的 是( C ) A．一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸 序列 B．限制性内切酶的活性受温度影响 C．限制性内切酶能识别和切割RNA D．限制性内切酶可从原核生物中提取
鱼类因其产卵量大且体外受精而成为研究转基因动物 转基因鱼的构建 的最佳入选动物 。
剪切 拼接 导入 表达
（一）获得 （二）形成
（外源基因） 目的基因 大麻哈鱼生长激素基因
重组DNA分子 运载体DNA+目的基因
受体细胞 （三）将重组DNA分子导入大西洋鲑受精卵 （四）目的基因的检测和表达
基因工程的概念 （重组DNA技术）
思考能否切割烟草花叶病毒上人们想要的目的基因？
EcoRI
识别GAATTC序列，并在G和A之间切开
限制酶在切断DNA时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸， 他们之间碱基正好互补配对，因此称这些片断为粘性末端。 5′ 3′
3′
5′
4、作用部位：
磷酸二酯键
重播
5、作用特点： 专一性--识别特定的序列、有特定的切点
5′
3′
DNA
3′ 5′
5′
T
GCA
A TGC A
CGT A
3′
3′
AC G
T
GCA
5′
TGC T 注意： 一般情况下，在获得目的基因的过程中，用 外源基因 一种或两种的限制性内切酶来酶切。
思考：
要想获得某个特定性状的基因必须要用限制性核 酸内切酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 切两个切口，产生四个黏性末端。