油菜总DNA的提取打印版
植物DNA提取
实验植物总DNA的提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。
由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。
同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。
本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。
[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB，十六烷三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide，一种阳离子去污剂），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。
CTAB 是一种阳离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。
植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、剪刀6、陶瓷研钵和杵子7、磨口锥形瓶（50ml）8、滴管9、细玻棒10、小烧杯（50ml）11、离心管（50ml）[实验试剂]1、CTAB buffer（pH8.0）2%W/V CTAB，1.4 mol/l NaCl，20m mol/l EDTA，100m mol/l Tris-HCl(pH8.0)，0.2%V/V巯基乙醇共100mL：称取2gCTAB，8.18gNaCl，0.74gEDTA Na2·2H2O，加入10mL1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)，0.2mL巯基乙醇，加水定容至100mL。
用于PCR分析的芥菜型油菜总DNA的快速提取
用于ＰＣＲ分析的芥菜型油菜总ＤＮＡ的快速提取摘要通过对所提DNA质量、效率和PCR检测，建立和优化了可用于PCR 分析的芥菜型油菜总DNA的提取方法，这一方法快速，所提的DNA质量好，可在芥菜型油菜生长发育早期进行。
关键词芥菜型油菜；快速提取DNA；PCR分析中图分类号Q523；S565.401文献标识码A文章编号1007-5739（2008）16-0172-02DNA的快速提取是分子标记技术广泛应用的基础。
一般植物DNA提取技术大都采用CTAB法、SDS法。
本研究在前人的基础上改进了DNA的提取方法，并根据油菜叶子蛋白多、脂类物质含量高、DNA难以提取的特点，选择了成苗时期叶片为材料，摸索可用于PCR分析的DNA快速提取方法，并优化了芥菜型油菜PCR反应体系。
1材料与方法1.1试验材料芥菜型地方品种为四川黄籽和紫叶芥的自交系。
1.2方法提取液配方采用文献法[1]，分别配SDS和CTAB提取液。
1.2.1油菜总DNA提取步骤。
①在新配DNA提取液中加β-巯基乙醇，每毫升提取液加4μL β-巯基乙醇备用。
②取0.5g幼嫩叶片，加液氮，研磨成粉末状。
迅速加入2mL上述提取液，轻轻摇动研钵，使材料在提取液中分散均匀。
③静置10min，用剪口的1mL吸头吸取600μL上清液匀速加入已编号的1.5mL灭菌eppendorf管中，每材料取2管（其中紫叶芥加适量的活性炭，吸附色素）。
④加入等体积的氯仿-异戊醇混合液（氯仿∶异戊醇=24∶1）充分摇匀，63℃水浴25min。
⑤取出离心管迅速置于-20℃冰箱冷却3～5min，12 000rpm离心5min。
⑥小心取出离心管，用剪口的0.2mL吸头吸取上清液300μL，合并2管上清液。
⑦加入等体积的氯仿-异戊醇，充分混匀，12 000rpm离心4min。
⑧用剪口的0.2mL 吸头吸取上清液400μL转入1.5mL离心管中，加入3mol/L NaAC使其终浓度至0.3M（每100μL上清液加11.11 μL 3mol/L NaAC），混匀。
CTAB法大量提取油菜基因组DNA
CTAB法大量提取油菜基因组DNA这种方法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的简便方法。
CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7 mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
一材料、试剂和仪器1 材料新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料2 试剂(1) 2×CTAB (2% CTAB)(2) 10% CTAB(3)0.1×TE(4)苯酚/氯仿/异戊醇（25/24:1）(5)氯仿/异戊醇（24:1）(6)5 M NaCl(7)RNaseA 10mg/ml(8)0.1 M EDTA pH 8.0(9)1 M Tris-HCl pH 8.0(10)乙醇/异丙醇(11)β-巯基乙醇(12)75%乙醇3. 仪器: 离心机，恒温水浴, 台式高速冷冻离心机，电泳装置二、试剂配方：0.1 M EDTA pH 8.0 100 ml2.922 g EDTA(292.2)80 ml H2O调pH至8.0加水定溶至100 ml高压灭菌121℃ 20 min1 M Tris-HCl pH 8.0 100 ml12.11 g Tris(121.14)80 ml H2O用HCl调pH至8.0加水定溶至100 ml高压灭菌121℃ 20 min5 M NaCl 100 ml29.25 g NaCl加水定溶至100 ml高压灭菌121℃ 20 minTE pH 8.0 100 ml10 mM Tris-HCl (1 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0)1 mM EDTA pH 8.0 (1 ml 0.1 M EDTA pH 8.0)高压灭菌121℃ 20 min2×CTAB (2% CTAB) 100 ml100 mM Tric-HCl (10 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0)20 mM EDTA (20 mM 0.1 M EDTA pH 8.0)1.4 M NaCl (28 ml 5 M NaCl)2%CTAB （2 g CTAB）1%PVP (1 g PVP)高压灭菌121℃ 20 min用前加2%的β-巯基乙醇10% CTAB 100 ml10% CTAB （10 g）0.7 M NaCl （14 ml 5 M NaCl）加水定溶至100 ml高压灭菌121℃ 20 min三、实验程序1、取5 g叶片，液氮研磨成粉，立即转入50 ml预冷离心管，加入18ml 65℃2×CTAB （临用时加2%β巯基乙醇通风厨中操作），迅速充分震荡混匀，65℃温浴45 min，期间每隔5 min摇动混匀一次；2、加入20 ml酚/氯仿/异戊醇（25/24/1），颠倒混匀5 min，静置10 min，4℃ 10000g 15 min，取上清，重复此步骤一次；3、上清加入0.1体积10%CTAB，颠倒混匀，65℃ 10 min；4、等体积氯仿/异戊醇（24/1）抽提两次；5、向管中加入1/100体积RNase A（10 mg/ml）溶液，置37℃ 30 min。
用于PCR分析的芥菜型油菜总DNA的快速提取
ＤＮＡ 的快速 提取 是 分子标 记 技 术广 泛 应用 的基 础 。 一
清 液 １０ Ｌ， 入 ２倍体 积 冰 冷 无水 乙醇 ， 匀 ． ２ ￣ 冰 ５Ｄ 加 混 置一 ０（ ２
般 植物 ＤＮＡ提 取技 术大 都 采 用 ＣＴ Ｂ法 、ＤＳ法 。 研 究 Ａ Ｓ 本
在 前人 的基础 上改 进了 ＤＮＡ 的提取 方法 ． 并根据 油 菜叶 子 蛋 白多 、 脂类 物质 含量 高 、 ＤＮＡ难 以 提取 的特 点 ． 选择 了成 苗 时期 叶 片为 材 料 ， 索可 用于 Ｐ 摸 ＣＲ 分 析 的 ＤＮＡ快 速 提 取 方法 ， 并优 化 了芥 菜型 油菜 Ｐ Ｒ 反应体 系 。 Ｃ
（５ ） ｇ幼 嫩叶 片 ， 液 氮 ， 磨成 粉 末 状 。 ． 加 研 迅速 加 入 ２ ｍＬ上述
ＮＣＣＩ 由上 海 生物 工程 技 术 服 务有 限公 司 合成 。 ２ １ ； 反应 体 系
和扩 增程 序 参照 《 向新基 因 分子 克隆 策策 略 》 方法 进 行 靶 的
优 化 纠 反 应 体 系 总 体 积 为 ２ １ ， 应 体 系 各 成 分 见 表 １ 。 ５ Ｌ反 ＊ 。
１ 材 料 与 方 法
箱 ２ ｍｉ 。 １ ０ ｒｍ 离心 ３ ｎ 倒 去 上清 液 ， ７ ％乙醇 ０ ｎ ⑩ ００ ０ｐ ｍｉ ， 用 ０
洗 涤 ２ ３ 。 瞬时 离心 ， ２ Ｄ － 次 ⑩ 用 ０ Ｌ吸 取 残留 液体 ， 置于超 净
工 作 台 上 吹 干 。 用 灭 菌 超 纯水 或 Ｔ １ｍｍｏ／ ｉ Ｃ ： ⑥ Ｅ（０ ｌＬＴｒ— Ｉ ｓ ０ ｍｍｏ／ ＤＴ １ ０ Ｌ溶解ＤＮＡ。 用核 酸 蛋 白质 分 析仪 ． １ ｌＬＥ Ａ）０ １ ｘ ⑧
最新实验8 植物组织总DNA的提取资料讲解
称取样品，液氮研磨，加入预热的(65℃ ) CTAB及β-巯基乙醇
保温1h,期间不停的摇均
吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒 混匀,10000rpm,10min
取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀, 10000rpm,10min
取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 ℃ /-20 ℃保温沉淀
CTAB, SDS等离子型表面活性剂，能溶解细胞 膜和核膜蛋白，使核蛋白ห้องสมุดไป่ตู้聚，从而使DNA得以 游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性， 并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强， 经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋 白质。上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉 淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总DNA 溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯 仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。
（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注 意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的 纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75% 乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管 尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中； （11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解； （12） 10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加 入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；
实验8 植物组织总DNA的 提取
二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细 胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化 酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲 液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降 低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎， 并减少研磨过程中各种酶类的作用。
用于RAPD分析的油菜总DNA的快速提取
西北农业学报 2001,10(3):32～34A cta A g riculturae Bor eali-occident alis Sinica用于RAPD分析的油菜总DNA的快速提取王灏,王道杰,谭小力,胡选萍,李殿荣(陕西省杂交油菜研究中心,陕西大荔 715105)摘 要:通过CT A B法、纯化法和简便法所提DN A质量效率和PCR-RA P D扩增效果的比较,优化和建立了无液氮处理,可用于RA PD分析的油菜总DN A的提取方法。
该方法能在油菜生长发育早期进行单株微量的提取,快速进行RA PD分析和品种鉴定。
关键词:油菜DN A;快速提取;RA PD分析中图分类号:S634.3文献标识码:A 文章编号:1004-1389(2001)03-0032-03A Simple and Rapid Method for the Preparation of PlantGenomic DNA by RAPD AnalysisWang Hao,Wang Dao-jie,T an Xiao-li,Hu Xuan-ping,Li Dian-rong(Hybrid Rapeseed Research Center of S haanxi Provin ce,Dali S haanxi 715105)Abstract:Based on experim ents and comparison of quality and RAPD results of g enom ic DNA w ith differ-ent ex traction method,including CTAB method,purification method and simple method,w as established a sim ple,rapid and low cost method on DNA ex traction from rapeseed leaves and shoots.It was especially suitable to DNA trace ex traction from rapeseed single shoot or young plant.With this method,materials need not to be treated w ith liquid nitrogen.Key words:Rapeseed DNA;Ripd ex traction;RAPD analysis DNA的快速提取是分子标记技术实用化的基础。
提取西藏油菜总DNA的一种方法
紫外分析仪结果 亮斑较模糊 亮斑暗但有拖尾 点样孔处较亮 亮斑清晰但有拖尾
A5
0 052
0 028
1 86
亮斑清晰明亮
A6
0 062
0 034
1 7
亮斑暗淡点样孔处较亮
注 : 原 溶 液 DNA 浓 度 = OD260nm 50ng / l
稀 释 倍 数 ( 300)
锭 2 ,l 放入微波炉中中火 2m in , 取出后轻轻摇晃, 防 止灌胶时出现气泡, 插入样板梳将胶板前端稍微抬起 从灌胶口把胶灌入, 待胶流到低端后放平、 静置 10~ 15m in , 使胶充分凝聚。 DNA 样品 6 , l于 1 4 % 琼脂糖凝胶 U = 80v , t= 1 5h , 1 TAE 缓冲 液电泳检测 ( 电泳仪为 DYY - 6C 型 , 电泳槽为 DYCP - 31D 型 ) , 胶板于数码凝 胶图象 处理系统 ( GIS- 2008 型 ) 上观测, 显示为在点样孔附 9
1 材料与方法
1 1 植物材料 材料采集以生态学和遗传学的采样原则, 选择具 有 典型 代 表 性, 无病 虫 害 生 长 正常 的 白 菜 型 油 菜 ( B rassicaCam pestris) 新鲜幼叶 ( 西藏大 学农牧学院农 场 )。 1 2 试剂配制 10% SDS 存放。 1MT ris- HC l( pH 7 5) 放、 预冷使用。 0 5 MEDTA ( p H 8 0) 18 61gN a2 EDTA 灭菌、 4 存放、 预冷使用。 5MN aC l 2 92gNaC l溶于 80m l水, 定容至 100 m ,l 高压灭菌。 3MKA c 2 94gKAC 溶 于 80m l 水 中, 定 容 至 100m ,l 4 存放、 预冷使用。 3MN aAc 2 46gNaAC 溶于 80m l水中 , 用 HAC 调 p H值 5 2 , 定容至 100m ,l 高压灭菌、 4 存放。 1 TE 溶 液 1MT ris - H C l 10m ,l 0 5MEDTA H 2 O 溶于 80m l水, 约加 2gN aOH 调 p H8 0 , 定容至 100m , l 高压 12 1gT ris 溶于 80m l水, 加浓盐酸, 调 pH 7 5 , 定容至 100m , l 高压灭菌、 4 存 10gSDS , 加 热助 溶于 100m l 水 , 室 温
多种.植物总DNA提取方法及详细步骤
植物总DNA提取一、常用方法改良CTAB法（改良自精编分子生物学实验指南，原蓝猪耳实验方案，拟采用）植物基因工程，王关林，2002 SDS法（植物基因工程，王关林，2002）高盐低pH值法（邹喻萍，植物学报，1994）材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。
材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。
材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。
材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。
试剂：(1)2-巯基乙醇（2-ME）(2)CTAB抽提液(3)CTAB/ NaCl溶液(4)24：1（V/V）氯仿/异戊醇(5)CTAB沉淀液(6)高盐TE缓冲液(7)70％乙醇(8)TE缓冲液试剂：(1)2×CTAB提取缓冲液试剂：(1)提取缓冲液：100mmol/LTris·Cl（pH8.0）、50mmol/LEDTA（pH8.0）、500 mmol/LNaCl、10 mmol/L 2-巯基乙醇（2-ME）(2)10% SDS(3)5mol/L KAC试剂：(3)提取缓冲液：100mmol/LNaAC（pH 4.8）、50 mmol/LEDTA（pH 8.0）、500 mmol/LNaCl、1.4％SDS，此种介质刚好为pH 5.5。
(4) 2.5mol/L KAc（pH 4.8）操作：(1)称取样品0.2g，去除表面的DNA污染，置于研钵中与液氮共研成细粉。
(2)将冻粉转入2ml离心管中，立即加入1000µl（980＋20）预热至65℃的CTAB抽提操作：(1)2ml离心管中加入1ml提取缓冲液，65℃预热。
(2)取0.2g新鲜幼嫩叶片，于液氮中迅速研磨成粉。
《植物总DNA的提取》课件
植物总DNA的提取也是植物生物技术应用的基础，如基因克隆、基因编辑、基因 转化和基因表达分析等。通过对植物总DNA的提取和操作，可以实现植物遗传改 良和新品种的培育，推动农业生产的可持续发展。
植物总DNA提取的应用
遗传资源保护
通过对不同植物种类的基因组分析，可以了解植物的遗传多 样性和进化关系，为植物种质资源的保护和利用提供科学依 据。同时，通过基因组学的研究，可以实现濒危植物的保护 和复壮。
废弃物处理
实验结束后，应将使用过的废弃物按照规定分类 处理，避免对环境造成污染。
防火防爆
远离火源和易燃物品，避免使用明火，存放和使 用易燃易爆试剂时需特别小心。
实验操作注意事项
试剂配制
严格按照试剂盒说明书或指导手册配制试剂，避免浓度和比例错误 导致实验失败。
样品处理
植物样品需新鲜且无菌，避免样品中存在杂质和微生物污染，影响 DNA提取质量。
使用酸性或碱性溶液使细胞膜破裂，释放出细胞内 的DNA。
离心分离
将破碎后的细胞悬浮液进行离心，使细胞碎 片和DNA沉降，上清液中的其他成分如蛋 白质和RNA得以去除。
DNA的沉淀与洗涤
盐析法
向离心后的上清液中加入高盐溶液，使 DNA沉淀析出。
VS
乙醇沉淀法
在上清液中加入无水乙醇，使DNA沉淀 析出。洗涤沉淀以去除残留的盐分和其他 杂质。
植物总DNA提取的步骤
植物材料的准备
选择适当的植物组织
根据实验需求选择适合的植物组织， 如叶片、根、茎等。确保植物材料新 鲜且无污染。
清洗与剪切
将植物材料清洗干净，剪切成适当大 小的组织块，以便后续操作。
细胞破碎与分离
物理破碎法
使用研磨棒、玻璃珠或匀浆器等工具破碎细 胞，释放出细胞内的DNA。
油菜种子高质量总RNA提取的一种有效方法_丁勇
收稿日期:2005O 12O 28*国家自然科学基金项目(30170600)和湖北省自然科学基金项目(2001ABD113)资助**通讯作者E O mail:ganli@丁勇,男,1979年生,华中农业大学植物科技学院硕士研究生,武汉430070文章编号1000O 2421(2006)05O 0465O 04油菜种子高质量总RNA 提取的一种有效方法*丁勇1)刘英2)杨鸯鸯1)甘莉1)**(1)华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉430070;2)东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室,哈尔滨150040)摘要 设计了1种从油菜种子中分离高质量总RN A 的方法,有效的排除了种子中富含的多酚、多糖和蛋白质等杂质的污染。
分离的总RN A 经甲醛变性凝胶电泳和紫外光检测,可见28S 和18S rRN A 的2条清晰的带型,完整无降解,其A 260/A280在1.8~2.0之间。
研究结果证明,利用本方法提取的油菜种子总R NA 具有很高的质量和纯度,且得率高,完全能满足后续的RT O PCR 、全长基因的克隆和No rthern blo tting 分析等分子生物学研究。
关键词油菜种子;R NA 提取;多酚;多糖;方法中图法分类号 S 565.403.53 文献标识码 A分子生物学研究是科学研究中很普遍的一种手段。
在分子生物学研究中,RNA 一直是其研究的主要内容之一。
植物组织RN A 的提取是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。
要进行RT O PCR 、cDNA 合成、RNA 序列分析、Northern 印迹杂交、狭线杂交、引物延伸、纯化mRNA 以用于蛋白质体外翻译或构建cDNA 文库,以及新近热门的用m R -NA 差异显示技术筛选感兴趣的相关基因等分子生物学研究,均需要有高质量、高纯度、完整性好的RNA 。
可以说,分子生物学研究后续工作的进展及成效在很大程度上取决于RNA 的质量。
植物总DNA的提取
实验1 植物总DNA的提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。
由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。
同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。
本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。
学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。
[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
本实验采用CTAB 法，其主要作用是破膜。
CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。
植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。
核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。
[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料[实验试剂]1、3×CTAB buffer（pH8.0）100mM Tris25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% β-巯基乙醇2、TE缓冲液（pH8.0）10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95％乙醇5、液氮[实验步骤]1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。
提取西藏油菜总DNA的一种方法
提取西藏油菜总DNA的一种方法
孟霞;常天军
【期刊名称】《西藏科技》
【年(卷),期】2010(000)008
【摘要】以西藏栽培的油菜为材料,采用不同的药品、不同的配方、不同的水浴时间、不同的离心速度等关键的操作程序,筛选出一种提取油菜总DNA效果较佳的方法.此方法提取的DNA纯化后经电泳、紫外吸收光谱检测证明为高分子量、高纯度的DNA,可用于一般的生物化学和分子遗传学的研究.
【总页数】3页(P8-10)
【作者】孟霞;常天军
【作者单位】西藏农牧学院,西藏,林芝,860000;西藏农牧学院,西藏,林芝,860000【正文语种】中文
【相关文献】
1.一种低危害的基因组DNA和总RNA的提取方法 [J], 贺庆华;邱翔
2.一种可直接用于PCR扩增的聚合氯化铝提取土壤总DNA的方法 [J], 涂祖新;王小红;张莉莉;金平;郑国华
3.一种快速提取香蕉叶片总核酸、总RNA和总DNA的新方法 [J], 柴娟;冯仁军;史后蕊;任梦云;王静毅;张银东
4.一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法 [J], 范惠玲;白生文;侯丽娟
5.一种有效提取油菜叶片总DNA的方法 [J], 李佳;沈斌章;韩继祥;甘莉
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基因组DNA的提取及实验方法
取下胶后，在染色液（1.0 g 考马斯亮蓝 R250，450 mL 甲醇，100 mL 冰醋酸，450 mL 双 蒸水）中染色 30 min，然后用脱色液（100 mL 甲醇，100 mL 冰醋酸，800 mL 双蒸水）脱色 1 d。
Rf 值及统计蛋白质亚基条带数
参照刘敏轩等（2006）的方法，根据电泳结果计算每个实验材料蛋白带的 Rf 值及统计 蛋白质亚基条带数。蛋白质的相对迁移率 Rf = 蛋白带迁移距离/溴酚蓝迁移距离。记录样品 中产生的多态性蛋白带，同一 Rf 值位置上有蛋白条带的记为 1，无蛋白带记为 0。输入计算 机，用 cluster 软件统计分析，根据 Main 方法构建表征树。
琼脂糖凝胶电泳检测结果。电泳时总电压为 120V，电泳 1h 左右，UV 检测扩增产物的多态
性。
PCR 扩增条件
二：
94℃ 94℃ X（按所用引物确定退火温度） 72℃ 72℃ 4℃
3min 30Sec 50Sec 1min 10min 保存
35 cycles
种子贮藏蛋白质样品的提取
按 Hurkman 和 Tanaka（1986）的苯酚为基准的总蛋白样品提取方法，并有所改进。将 0.5 g 成熟种子在液氮中研磨成粉末状，分别加入提取液 10mL [50% （v/v）苯酚, 0.45 M 蔗 糖, 5 mM EDTANa2, 0.2% （v/v）β-巯基乙醇, 50 mM Tris-HCl，pH 8.8]，充分混匀后将装有 匀浆液的离心管在 4℃条件下，摇床上振荡 30 min，然后 4℃ 5000 g 离心 15 min，吸取上清 液至新一离心管中加入 5 倍体积的-20℃的 0.1 M 乙酸铵（0.7708 g 乙酸铵溶解在无水的 100 mL 甲醇中），-20℃冰箱静置沉淀 16 h 或过夜。第二天 4℃ 5000 g 离心 10 min，沉淀的蛋白
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油菜总DNA的提取(CTAB法)
一．操作流程
植物样品的采集与保存
通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料，采集的过程中应尽可能使组织材料保持水分，在取样时通常将样品存放在2ml离心管或者4cm*5cm大小的薄膜袋中，然后将它们统一放置在密闭的冰盒中，这样可使组织材料3～5 d 仍然保持新鲜。
对于采集回来的样品如要长期保存，应经液氮处理后贮存在-80℃冰箱或直接储放于液氮中，且在与提取缓冲液接触前，应防止冰冻的样品在空气中融化，否则酚类易被氧化。
(一)植物样品的研磨
将每个需要研磨的单样（有时需要混样后再磨）迅速放入研钵中，直接用配套的研棒进行干磨，当植物组织完全磨碎后，再根据样品量的多少加入2%的CTAB，通常2cm2的油菜叶片加入量为700ul，再用研棒稍微研磨成匀浆，倒入2ml离心管中保存以备下一步使用。
（二）植物样品的水浴
将离心管中的植物组织匀浆装到离心管盒里，然后放到65℃的水浴锅里进行水浴1小时，前30分钟每隔几分钟摇晃一次，后30分钟每隔10分钟摇一次，原则是充分摇匀。
（三）加“24:1”溶液（氯仿：异戊醇）
将水浴好的匀浆放置冷却至室温，加入等体积的“24:1”溶液，手动轻轻上下摇晃15至20分钟。
然后12000rpm离心12分钟。
（四）吸上清
将离心好的离心管按顺序摆放在操作板上，将上清溶液吸到新的离心管中，通常吸取量为400ul，但也可以调整，基本原则是不能将位于上清液下面的残留组织吸到新离心管中。
（五）总DNA的析出
向上清液中加入1/10体积的醋酸钾溶液，然后加入等体积的冰乙醇，再轻轻摇晃几下，将冰乙醇与上清液充分混匀，放入-4℃的冰箱中静置30分钟左右。
（六）总DNA的离心
将静置后的离心管在12000rpm下离心3-5分钟，再倒掉上清液，加入76%的乙醇后静置5-6小时，加入76%的乙醇静置5-6小时的洗涤过程可重复操作1-2遍。
（七）晾干
将76%乙醇倒掉，然后将含有DNA的离心管置于室温进行自然晾干。
（八）DNA溶解
加入200ul事先已加入RNase的TE溶液到晾干的含有DNA的离心管中进行DNA溶解和RNA降解，溶解时间大概为1天左右，室温进行即可。
（九）DNA原液的稀释
将已经溶解好的DNA溶液（DNA原液）进行浓度测定，并按需要用ddH2O 进行稀释。
稀释后的DNA溶液（DNA模板）即可用于各种PCR操作。
二．试剂配方
1. 2%CTAB:
十六烷基三甲基溴化铵，其特性为在高盐(>0.7mol/L)浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0.1～0.5mol/LNaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
配方：
1.4mol(81.9g) NaCl
100mmol（12.114g）Tris HCl pH 8.0
20mmol（7.44g）EDTA pH 8.0
20g CTAB
将以上物质混合，再用纯水定容到1L
2. EDTA：
乙二胺四乙酸，抑制金属离子依赖性的酶(螯合Mg2+ 、Ca2+ ) 的活性。
配方：EDTA粉末
一般将所称量的EDTA用纯水溶解到所需浓度，再调节pH值即可
3.“24:1”：
氯仿/异戊醇的体积比为24:1所配制的溶液。
配方：氯仿，异戊醇
一般向一瓶新的氯仿（500ml）再加入500/24=20.83ml异戊醇，再轻轻摇匀即可。
4. KAc溶液：
Dellaporta等认为加入高浓度的KAc有利于除去多糖物质。
配方：粉末状醋酸钾
此操作中一般用的醋酸钾溶液为3mol/L
5. 冰乙醇：
低温可使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全，同时让DNA析出。
配方：无水乙醇事先将无水乙醇放入-20℃冷冻。
6. 76%乙醇+NH4Ac：
可洗脱掉溶液中残留的CTAB。
配方：无水乙醇，纯水，醋酸钾
一般向一瓶新的无水乙醇中取出120ml的无水乙醇，然后再加入120ml的纯水和10mmol（771mg或者2ml 5mol/LNH4Ac）NH4Ac轻轻混匀即可。
7. TE+RNase:
可以除去DNA中的少量RNA，同时能保证高的溶解效率。
配方：100mmol Tris HCl pH 7.5 （10ml 1mol/L）
1mmol EDTA pH 8.0 （2ml 0.5mol/L EDTA）
将上述两种物质混合，再加纯水定容到1L即可。
三．注意事项
1.磨样一定要带手套，并穿上工作服。
2.DNA析出后的离心时间不能太短，否则在后面的倒废液操作中容易将DNA倒出离心管外。
3.加入冰乙醇后一定要低温静置一段时间，否则会造成DNA析出不完全，导致提取量下降。
4.第一次离心后必须小心地将离心管取出，否则会破坏上清液，影响DNA质量。
5.以上所有试剂均为实验室最常用试剂，如发现用完了，请和试剂负责人联系后再购买。