Elisa溶液配制

Elisa溶液配制
或封闭液（1 % BSA）：每100 mL的PBST中加入1 g牛血清白蛋白（BSA），4℃保存
首先摸索PCV2抗原包被的最佳浓度，将PCV2抗原按照1/50、1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600稀释，一抗用强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清按照1/100稀释，于37 ℃孵育1.5 h，二抗用羊抗猪的酶标二抗，于37 ℃孵育1 h，加入TMB显色，测其OD450 nm值，选择阳性血清OD450 nm大于0.8，而阴性血清小于0.1的临界稀释度即为抗原的最佳包被浓度。

然后按照最佳的浓度包被96孔酶标板，每孔加入100 µL，于4℃包被过夜；次日用PBST（0.15M PBS＋0.05% Tween 20）洗涤3次，每次5 min 洗涤；用PBST溶解的1% BSA于37℃湿盒中封闭1-2 h，洗涤方法同上一步骤；然后向孔中加入起始浓度为300 μg/μL，按照1/5、1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640八个稀释梯度的VHHs，置于37 ℃湿盒中孵育2 h，此为反应的一抗；用PBST洗涤5次，每次5 min；加入100 µL抗His标签的HRP标记的鼠源单抗（1:2000稀释）作为反应的二抗，置于37℃湿盒中孵育1 h；再用PBST洗涤5次，每次5 min；最后每孔加入100 µL TMB显色液，室温避光显色10-15 min；显色结束后每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止显色，在A450 nm波长处读数。

同时用武汉科前生物有限公司提供的阳性血清（按照上述稀释梯度进行稀释）作为本实验的阳性对照，分别用BSA 和未接种病毒的PD3细胞裂解液包被酶标板，作为本实验的阴性对照1和2。

阳性对照组二抗反应时加入100 µL抗猪-HRP标记的酶标二抗，其余操作方法同上。