枯草芽孢杆菌的介绍-第二版本

枯草芽孢杆菌的介绍
完成者：河岸hkfced（/hkfced）完成时间：2012-3-23
版本：第二版本
目录
第一章芽孢杆菌的简要介绍 (1)
第一节芽孢杆菌种类 (1)
第二节芽孢杆菌的表达系统发展简史 (2)
第二章枯草芽孢杆菌的转化系统 (3)
第一节：常见转化方法 (3)
1 化学转化法 (3)
2 电转化 (3)
3 原生质体转化 (3)
4 碱金属离子转化 (4)
5 质粒的其它转移方式 (4)
第二节：标准操作 (4)
第一种方法：电转化 (4)
第二种方法：Spizizen转化 (5)
第三种方法：原生质体法(Takashi) (5)
第四种方法：原生质体转化之二 (6)
第五种转化方法：质粒混合法（BGSC推荐） (7)
第三章芽孢杆菌的表达系统 (8)
第一节芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌） (8)
第二节芽孢杆菌的缺点 (9)
第三节助表达系统 (9)
第四节芽孢杆菌基因表达的主要特点 (9)
第四章枯草芽孢杆菌的转录翻译系统 (9)
第一节：转录系统 (10)
第二节：翻译系统 (11)
第五章芽孢杆菌常用的宿主和载体 (12)
第六章芽孢杆菌应用实例 (13)
1 中国 (13)
2 日本 (13)
3 加拿大 (14)
第七章芽孢杆菌的产品 (14)
第一节核苷类产品 (14)
第二节核黄素 (14)
第三节微生物制剂/益生菌 (15)
第四节工业酶制剂 (15)
第八章结语 (15)
附录一. 芽孢杆菌的相关经典文章 (16)
附录二. 枯草芽孢杆菌相关数据库 (16)
致谢及参考文献 (17)
第一章芽孢杆菌的简要介绍
芽孢杆菌作为一个属，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。

目前人们对芽孢杆菌的研究几乎涉及到了革兰氏阳性可生孢细菌的各个领域。

尤其是在感受态、芽孢形成及其调控、遗传操作、菌种改良、生物技术等领域进行了大量的工作。

芽孢杆菌是一个泛泛的概念，而科学研究中应用最多的当属枯草芽孢杆菌，例如168菌株及其大量的衍生菌株。

枯草杆菌的研究之所以领先于其他芽孢杆菌的种，主要是由于他的转化、转导方法较完善，以及大量的衍生菌株。

目前应用最多的芽孢杆菌属菌种有枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等12种。

第一节芽孢杆菌种类
目前，芽孢杆菌属很多菌株的全基因组序列已经报道，截至2011年10月（目前远不止这个数字，NCBI公布的更多），在KEGG上公布全基因组序列的芽孢杆菌属菌种有：简称菌种名称测序时间测序链接
bsu Bacillus subtilis1997RefSeq
bss Bacillus subtilis subsp. spizizenii W232010RefSeq
bst Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-102011 RefSeq
bsn Bacillus subtilis BSn52011RefSeq
bha Bacillus halodurans2000RefSeq
ban Bacillus anthracis Ames2003RefSeq
bar Bacillus anthracis Ames 05812004RefSeq
bat Bacillus anthracis Sterne2004 RefSeq
bah Bacillus anthracis CDC 6842009 RefSeq
bai Bacillus anthracis A02482009 RefSeq
bal Bacillus cereus biovar anthracis CI2010RefSeq
bce Bacillus cereus ATCC 145792003RefSeq
bca Bacillus cereus ATCC 109872004RefSeq
bcz Bacillus cereus ZK2004RefSeq
bcr Bacillus cereus AH1872008 RefSeq
bcb Bacillus cereus B42642008 RefSeq
bcu Bacillus cereus AH8202009 RefSeq
bcg Bacillus cereus G9******* RefSeq
bcq Bacillus cereus Q12009RefSeq
bcx Bacillus cereus 03BB1022009 RefSeq
bcy Bacillus cytotoxis NVH 391-982007RefSeq
btk Bacillus thuringiensis 97-272004RefSeq
btl Bacillus thuringiensis Al Hakam2006RefSeq
btb Bacillus thuringiensis BMB1712010RefSeq
bwe Bacillus weihenstephanensis2008 RefSeq
bli Bacillus licheniformis ATCC 145802004RefSeq
bld Bacillus licheniformis DSM132004RefSeq
bay Bacillus amyloliquefaciens FZB422007RefSeq
bao Bacillus amyloliquefaciens DSM 72010RefSeq
bae Bacillus atrophaeus2010 RefSeq
bcl Bacillus clausii2005 RefSeq
bpu Bacillus pumilus2007RefSeq
bpf Bacillus pseudofirmus2010 RefSeq
bmq Bacillus megaterium QM B15512010 RefSeq
bmd Bacillus megaterium DSM 3192010 RefSeq
bse Bacillus selenitireducens2010 RefSeq
bco Bacillus cellulosilyticus2011 RefSeq
bck Bacillus coagulans2011 RefSeq
bag Bacillus coagulans 36D12011 RefSeq
第二节芽孢杆菌的表达系统发展简史
芽孢杆菌表达系统是在70年代从枯草芽孢杆菌，又称枯草杆菌（Bacillus subtilis）开始，逐步扩展至其它种的。

枯草杆菌能发展成为芽孢杆菌中的第一个基因工程表达系统是与其早期的遗传学工作密切相关的。

Spizizen于1958年发现枯草杆菌168菌株为可转化菌株以来，枯草杆菌的遗传学工作不断深入和发展。

美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心（BGSC，/）至1999年保藏的168菌株的遗传突变株就有890个。

它牵涉到了诸多营养要求、各种酶、芽孢形成和发芽、感受态、Sigma因子、DNA重组与修复以及正负调控等各方面基因的突变体。

70年代发明了DNA重组技术以后，特别是发现金黄色葡萄球菌的带有抗性标志的质粒可作为枯草杆菌的载体以后，克服了枯草杆菌只有隐秘性质粒的困难，枯草杆菌基因工程的工作更是加速发展。

迄今，已经在枯草杆菌及其近缘种中克隆和表达了大量的原核和真核基因，其中有的已应用于工业化生产，取得了不少成绩。

将携有外源基因载体导入宿主细菌中是细菌基因工程表达系统的必要条件。

大肠杆菌的氯化钙转化法对枯草杆菌无效，所以枯草杆菌基因工程表达系统中的宿主菌株用的最广泛的就是在DNA重组技术发明之前就可以进行感受态转化的168菌株及其突变体。

Spizizen感受态转化的基本原理：是细胞在Spizizen最低盐培养基中形成一段饥饿、易于摄取外源DNA
片段的时期。

一般步骤是先将其在较为丰富的培养基中培养，然后转接到贫瘠的培养基中，使其形成感受态（一般非常短暂）。

有关感受态时期参与摄取外源DNA的几种蛋白及其摄取机制已有初步的研究。

第二章枯草芽孢杆菌的转化系统
第一节：常见转化方法
1 化学转化法
芽孢杆菌属不能够使用大肠杆菌常用的化学转化法，枯草芽孢杆菌表达系统中应用最为广泛的的宿主菌株是在DNA重组技术发明之前就可进行感受态转化的168菌株（色氨酸缺陷型）及其突变体。

对于B. subtilis来说，自然感受态是对数生长后期在一种二元信号转导系统的调节下形成的，需要一系列相关基因的调控。

按照这些基因的功能和表达时间的先后，它们被分为早期感受态基因和晚期感受态基因。

其中早期基因主要对感受态的形成起调节作用，并进一步促进晚期感受态基因的表达。

而后者主要负责细胞对外源DNA的吸附、吸收和重组。

B. subtilis的自然感受态是在对数生长后期开始形成的。

这种生理状态的形成受到感受态信息素的调节，只有当细胞达到一定的数目（一般在对数后期）时，细胞所分泌到培养基中的感受态信息素的浓度达到一定临界值时后，感受态才能被诱导形成。

2 电转化
对于绝大多数微生物来说电转化是常见的转化效率最高的一种方法，芽孢杆菌属首次使用电转化方法转化出现在1989年，目前芽孢杆菌属内最常使用的B. subtilis的转化率已经达到104- 106。

对于化学转化法，芽孢杆菌属形成感受态的时间并不好把握，另外由于其感受态的形成受到诸多基因的控制，对于一些经过诱变的工业生产株，往往不能形成感受态，所以在实际操作中，一般采用电转化将外源DNA导入宿主细胞。

由于电转化方法具有操作简单、实验结果重现性好、参数容易控制等优点，目前已被许多实验室用来进行芽孢杆菌的基因转化。

但是，电转化法的操作条件对转化效率影响很大，因此最佳条件的建立非常重要。

影响电穿孔转化率的几个主要因素包括感受态的制备方法、电击压力、感受态和DNA溶液中离子浓度、复苏液的选择和复苏时间等。

3 原生质体转化
原生质体转化技术是20世纪60年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，是将细胞通过酶解破壁，使之成为球状的原生质体，然后与DNA混合于高渗缓冲液中，在聚乙二醇（PEG）介导下，使原生质体-DNA发生相互凝聚，进行遗传转化，然后在适宜的条件下再生细胞壁，获得转化子的过程。

原生质体转化开辟了育种工作的新途径。

自1953年Weibull 首次用溶菌酶酶解分离巨大芽孢杆菌的原生质体，1979年Chang等[创立了原生质体转化技
术后，它很快应用在微生物中，并得到了证实，成功地实现了酵母菌、霉菌和细菌等微生物的转化。

B. subtilis经过一定处理后能够形成原生质球，这种原生质球经聚乙二醇（PEG）处理后，能再生细胞壁而成为转化细胞，这种转化的转化频率非常高，B. subtilis原生质球转化时有80%细胞被转化。

质粒DNA的单体、多聚体以及开环DNA都可以转化。

线形质粒DNA的转化效率大约为环状分子的1%。

最为重要的是这种方法能够转化不能形成感受态细胞的B. subtilis，另外许多其它种的芽孢杆菌也能够使用这种转化方法。

但是这个质粒转化系统在实际操作中应用较少，因为使用原生质体转化时，大质粒的转化效率较低。

并且原生质体的再生需要营养丰富的再生培养基，因此不能从再生培养基上直接选择营养缺陷型标记的克隆子。

4 碱金属离子转化
碱金属离子转化法是新近发展起来的一种芽孢杆菌转化方法。

碱金属离子诱导转化B. subtilis的标准程序如下：收集处于对数生长中期的菌体，先用4.1 mol/L的KCl溶液在30 ℃处理，然后加入质粒，30 ℃静置30 min，加入等体积的70%的PEG6000溶液，缓慢混合，30 ℃保温10 min，再置于42 ℃水浴5 min，30 ℃冷却。

上述PEG悬浮液经稀释后离心收获菌体，用新鲜培养基悬浮，并在37 ℃震荡培养2 h，扩增后的细菌培养液即可涂布选择性平板进行筛选。

这种转化方法己知适用于B. subtilis NB22和短短小芽孢杆菌等菌株。

在所有的金属离子中，只有达到饱和浓度的K+和Cs+离子有效，在一定浓度内其转化率与DNA 量成正比。

这种方法的最大特点是线型质粒分子转化率虽然较环状分子低，但明显高于用线型质粒转化感受态细胞。

对于染色体DNA片段而言，情况正好相反，也就是说，稀土金属离子转化法能特异性地转化质粒DNA。

5 质粒的其它转移方式
此外，在枯草芽孢杆菌之间，以及枯草芽孢杆菌和大肠杆菌之间，还可以细胞融合相互转移质粒。

在苏云金芽孢杆菌中又发现了一种类似接合方式转移质粒的现象。

第二节：标准操作
第一种方法：电转化
实验试剂：GM:LB+0.5M 山梨醇；ETM:0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油；RM：LB+0.5M 山梨醇+0.38甘露醇
电转仪：eppendorf
方法（本人亲自验证，使用的菌株为WB600，质粒为PWB980，/s/blog_60ea2d8f0100q173.html）：
1）新鲜平板挑单菌落（小一点为好）接种于5ml LB培养基中，过夜培养.。

2）测量摇管内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。

培养基为50ml GM。

37℃，200rpm培养至OD600=1.0（大约3-4小时）左右。

3）取全部菌液冰水浴10 min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。

4）用40ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。

5）将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl.
6）将60μl感受态细胞中加入1-6 μl质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。

电转仪设置：2.0kv（另外我还尝试过0.8kv，1.2kv），25μF200Ω，1mm，电击1次. （持续时间4.5ms-5ms之间）
7）电击完毕立即加入1ml 复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。

37℃，过夜培养
第二种方法：Spizizen转化
取新鲜活化菌种一环接入装有5mLGM1培养基的试管中，37℃、200rpm培养过夜，取500μL菌液转接入相同的GM1培养基中，37℃、200rpm培养4-5小时使菌体生长达到对数期末期，然后取0.75mL GM1菌液接入装有5mLGM2培养基的试管中，37℃、200rpm培养1.5小时，制得感受态细胞，将待转化质粒DNA与1mL感受态细胞混匀后在37℃静置1小时，然后37℃，200rpm震荡培养1-1.5小时，取适量菌悬液涂布选择培养基，37℃培养24-48h后，挑选转化子。

10×Spizizen基本盐培养基(g/L)：(NH4)2SO4 2，K2HPO4 8.3，KH2PO4 6，柠檬酸钠1.2，无离子水配制。

0.1Mpa压力下灭菌20min。

Spizizen基本培养基：10×Spizzen基本盐培养基100ml/L，50%(w/v)葡萄糖10ml/L，色氨酸母液（5mg/ml）10ml/L，琼脂1.5%（w/v）。

0.06Mpa压力下灭菌20min。

GM1培养基和GM2培养基：母液0.1Mpa压力下灭菌20min后按下表混合。

母液GM1培养基GM2培养基
40%葡萄糖100μL 100μL
20mg/mL酸水解酪素100μL 50μL
50mg/mL酵母抽提物100μL 0μL
20%(w/w)MgSO4.7H2O 5μL 40μL
10×Spizzen基本培养基500μL 500μL
H2O 3195μL3310μL
总体积5000μL 5000μL
第三种方法：原生质体法(Takashi)
1、活化：从活化24小时新鲜的CM平板上挑取单个菌落，接种于30ml CM液体培养基中，37℃过夜培养。

2、转接：次日取2%菌液接种于新的30ml CM液体培养基中，培养3h左右，至OD570为0.4~0.8。

3、收集菌体：取30ml菌液，4℃下3500rpm离心10min，弃上清。

用10mlSMM洗涤两次。

4、制备原生质体：约用6ml SMM重悬，使OD570为2.0，加入溶菌酶（终浓度200μg/ml）在37℃慢摇作用30min，制备原生质体。

5、原生质体高渗悬液的制备：3500r/min离心15min，弃上清。

用10ml SMM洗涤一次。

原生质体重悬于300μl SMM中，得到“原生质体高渗悬浮液”。

6、转化：将待转化的40μl质粒DNA（约1μg）与10μl CaCl2溶液（2mol/l）混匀，再与50μL的2*SMM溶液混匀，加入100μl待转化菌株的“原生质体高渗悬浮液”，混匀后冰浴10min，加入40%的PEG4000溶液1800μl，混匀后冰浴1min后立即加入30ml HCP-1.5溶液以终止PEG4000的作用；3500r/min离心15min，弃上清，收集转化后的原生质体；用5 ml HCP-1.5溶液重新悬浮，30℃静置培养3~5h.。

7筛选：取500μl菌液转至5ml HCP-1.5半固体培养基中，混匀。

加入kann（50μg/ml）抗性HCP-1.5再生平板中，37℃夹层培养。

CM培养基
葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母抽提物2％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，pH7.2，115℃灭菌15min
2*SMM培养基
蔗糖342.4g（1M），顺丁烯二酸4.46g（0.04M），MgCl2·6H2O 8.12g（0.04M）加去离子水定容至1000mL，pH7.5，115℃灭菌15min
HCP-1.5培养基
250ml琥珀酸钠（2M PH7.3），酪蛋白水解物5g，酵母抽提物5g，MgCl2·6H2O 1.9g，葡萄糖5g，K2HPO4 3.5g ，KH2PO4 1.5g，聚乙烯吡咯烷酮15g ，115℃灭菌15min
再生培养基：HCP-1.5培养基加2%琼脂
半固体HCP-1.5培养基：HCP-1.5培养基加0.8%琼脂
溶菌酶（一般用途）用水配制成50mg/mL溶菌酶溶液，分装成小份，保存于-20℃。

第四种方法：原生质体转化之二
1、活化：从活化24小时新鲜的LB平板上挑取单个菌落，接种于30mL LB液体培养基中，37℃过夜培养。

2、转接：次日取10%菌液接种于新的30mL LB液体培养基中，培养3h。

3、收集菌体：取30mL菌液，4℃3000rpm离心10min，弃上清。

用20mL SMMP洗涤一次。

4、破壁：制备原生质体：用1mL SMMP(含0.1mg/mL溶菌酶），在37℃作用20min，制备原生质体。

5、原生质体高渗悬液的制备：3000r/min离心10min，弃上清。

用10mL SMMP洗涤一次。

原生质体重悬于500μL SMMP中，得到“原生质体高渗悬浮液”。

6、转化：将待转化的质粒DNA50μL（约1μg）与等体积的2*SMM溶液混匀，加入500μL待转化菌株的“原生质体高渗悬浮液”，混匀后冰浴30min，室温放置10 min。

7复苏：取500μL菌液转至5mLSMMP摇管中，37℃，150rpm培养5h后，加入kann （50μg/mL）抗性再培养5h。

涂布在kann（50μg/mL）抗性平板上挑选转化子。

2*SMM培养基：
蔗糖172.2g（0.5M），顺丁烯二酸 2.23g（0.02M），MgCl2·6H2O 4.06g（0.02M）加去离子水定容至1000mL，pH7.0，115℃灭菌15min
SMMP培养基：
蔗糖172.2g（0.5M），顺丁烯二酸2.23g（0.02M），MgCl2·6H2O 4.06g（0.02M），葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母抽提物1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，K2HPO40.5%加去离子水定容至1000mL，pH7.0，115℃灭菌15min
CMR完全再生培养基：
蔗糖172.2g（0.5M），顺丁烯二酸2.23g（0.02M），MgCl2·6H2O 4.06g（0.02M），葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母抽提物1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，K2HPO40.5%，调pH7.2～7.5，而后加入1.5％的琼脂粉，115℃灭菌15min.
溶菌酶（一般用途）用水配制成50mg/mL溶菌酶溶液，分装成小份，保存于-20℃。

溶菌酶(原生质体转化)普通溶菌酶0.22μm过滤灭菌后，用SMMP调制成1mg/mL的终浓度。

第五种转化方法：质粒混合法（BGSC推荐）
Competence development in B. subtilis is one of several stationary phase processes triggered by a nutritional downshift. Since the pioneering work of Anagnostopolous and Spizizen, number of protocols for preparing competent B. subtilis cells have appeared. The following method, modified by Ron Yasbin from protocols developed in the Frank Young lab at Rochester, was used routinely in Stan Zahler’s wonde rful bacterial genetics course at Cornell. This protocol assumes that you use a spectrophotometer that accepts 16×125 mm test tubes. If your spectrophotometer, like mine, works only with cuvettes, simply increase the culture volume to 10 or 20 ml in a 250-ml Erlenmeyer flask.
1. Streak recipient strain on one-half of a Tryptose Blood Agar Base plate. Incubate overnight (18 hr) at 37°C.
2. Inoculate a few colonies into 4.5 ml of Medium A in a 16×125 mm test tube that lacks visible scratches. Mix the contents of the tube thoroughly. Read its optical density at 650 nm in the spectrophotometer. Adjust the OD650 to be 0.1-0.2, maintaining the volume at 4.5 ml.
3. Incubate at 37°C with vigorous aeration. Read the OD650 every 20 min, plotting OD650 against time on semi-log paper. After a brief lag, the OD should increase logarithmically—that is, they should fall on a straight line. Note the point at the culture leaves log growth—the graph points fall below the straight line. In B. subtilis genetics, this point is known as t0. It should take 60-90 minutes of incubation and occur at OD650=0.4-0.6.
4. Continue incubation for 90 minutes after the cessation of log growth (t90). Transfer 0.05 ml of this culture into 0.45 ml of pre-warmed Medium B in a 16×125 mm test tube. Set up one tube for each transformation you intend to perform, plus an extra for a DNA-less control.
5. Incubate the diluted cultures at 37°C with vigorous aeration for 90 min. At this point, the cultures should be highly competent.
6. Add 1 μg of DNA to the competent cells and incubate at 37°C with aeration for 30 minutes.
7. Plate aliquots of the transformed cells onto selective agar.
10× Medium A base:
Yeast extract 10 g
Casamino acids 2 g
Distilled water to 900 ml
Autoclave, then add: 50% glucose, filter-sterilized 100 ml
10× Bacillus salts
(NH4)2SO4 20 g
K2HPO4·3H2O 183 g
KH2PO4 60 g
Na+citrate 10 g
MgSO4·7H2O 2 g
Water to 1000 ml
Medium A
Sterile water 81 ml
10× Medium A base 10 ml
10× Bacillus salts 9 ml
Medium B
Medium A 10 ml
50 mM CaCl2·2H2O 0.1 ml
250 nM MgCl2·6H2O 0.1 ml
第三章芽孢杆菌的表达系统
生物安全性要求我们的宿主菌最好具有非致病性。

而绝大多数芽孢杆菌恰恰能满足这一要求，而且还具备了一些其他菌株所没有的优良特性。

事实表明，芽孢杆菌可以作为一些原核生物、真核生物和哺乳动物等的外源蛋白的表达宿主。

有的已经大规模投入生产。

蛋白质分泌（Protein Secretion）是指蛋白质经由细胞膜向细胞外运输的过程，又称为易位（Translocation）。

蛋白质分泌是Bacillus的一大特点，蛋白质组学研究表明，B. subtilis 中至少有4种蛋白质分泌途径，大约有300个蛋白质可以被分泌到胞外。

B. subtilis中主要的蛋白质分泌途径主要包括（1）Sec分泌途径和（2）Tat分泌途径，其它分泌途径有ABC 转运子途径（ABC Transporter），主要用于细菌素等分子的输出；（3）Com分泌途径，它与B.subtilis细胞感受态形成有关，负责此过程中外源DNA的结合和摄取，该过程是通过ComGC、ComGE、ComGD和ComGG这四个蛋白质实现的，经由该途径输出的蛋白质其前体信号肽由第四类信号肽酶（Type IV SPase）切割。

微生物将蛋白质分泌到胞外是为了实现所需的生理功能。

因B.subtilis蛋白质分泌功能发达，其主要的分泌途径可被用于外源蛋白质的高水平分泌表达。

蛋白质分泌机理和应用技术是B. subtilis研究的重要课题。

深入研究其分泌途径的机理，有可能克服其中存在的分泌瓶颈，将B.subtilis改造成为一个优秀的外源蛋白质分泌工厂。

第一节芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌）
1、非致病性：除个别种（炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌）外对人畜无害。

2、转化外源DNA的感受态系统也同样适用于转化重组DNA。

3、质粒和噬菌体都可以作为克隆的载体。

4、细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖和磷璧质，因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂有胞被内毒素（热源性脂多糖），而这一点是大肠杆菌无法比拟的。

5、能够大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中而不发生聚集，回收和纯化蛋白较为简单。

例如：α淀粉酶、蛋白酶及杀虫晶体蛋白等。

6、良好的发酵基础和生产技术，在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。

7、没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体：在E.coli表达系统中，若重组表达的外源蛋白质中含有大量连续的稀有密码子，则常常造成表达量低，或者翻译提前终止；而目标蛋白质产物形成包涵体会导致蛋白质不可溶，给分离纯化和回收目标蛋白质造成麻烦。

而B.subtilis表达系统在这两个方面都不存在问题。

第二节芽孢杆菌的缺点
1、能够产生大量的胞外蛋白酶，往往造成表达产物的大量降解。

2、能自发形成感受的的菌株极少，感受态持续时间短暂，分子克隆效率低。

3、存在限制和修饰系统，重组质粒不稳定。

第三节助表达系统
芽孢杆菌拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统（参考文献：Tjalsma H, Bolhuis A, Jongbloed JDH, Bron S, Dijl JM (2000) Signal Peptide-Dependent Protein Transport in Bacillus subtilis: a Genome-Based Survey of the Secretome. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 515–547.），利用好这些有用的元件，就可以完成目的蛋白的高效分泌表达，从而避免讨厌的包涵体的形成！
第四节芽孢杆菌基因表达的主要特点
1、对数生长期后进入芽孢形成期，不同的芽孢形成阶段所表达的基因不尽相同。

2、多Sigma因子：RNA聚合酶全酶由5个亚基（α 2 β β’ ）组成。

σ因子的主要功能是帮助核心酶识别特定的启动子而结合到转录的起始部位，转录开始后就不起作用了。

芽孢杆菌中已发现的σ因子有7种，而大肠杆菌只有2种。

因而，大多数阴性菌的基因不能够在芽孢杆菌中直接表达而需要更换启动子等元件。

3、核糖体结合为点（RBS）：枯草杆菌最典型的SD序列是―GGAGG‖，而大肠杆菌的为―AAGGA‖。

4、大肠杆菌分泌蛋白往往分泌到两层细胞膜之间，而芽孢杆菌只有一层细胞膜，因而可以大量分泌蛋白至培养基中。

通过计算机分析，枯草杆菌有将近300个N端具有信号肽用来跨膜的蛋白。

不过用来表达和分泌克隆基因的信号肽主要来自蛋白酶、淀粉酶和细胞壁表层蛋白等。

总的来讲，人们选择不同种的芽孢杆菌作宿主，一般都有着极强的应用研究的目的。

目前许多实验室现在也在自主开发野生的芽孢杆菌表达系统，一是看中了其高效分泌表达的能力；另外，对于菌剂产品来讲，将外源基因在芽孢杆菌中表达，可以大大延长产品的货架期。

第四章枯草芽孢杆菌的转录翻译系统
构建表达载体常用的启动子序列比较
启动子名称－35区间隔序列长度－10区
Ptrp TTGACA 17 TTAACT
Ptyr-tRNA TTTACA 16 TA TGA T
Plac TTGACA 17 TA TGTT
PrecA CTGA TG 17 TA TAA T
Para TTGACA 17 TACTGT
λPL TTGACA 17 GA TACT
λPR TTGACA 17 GGTAA T
SPO1 TTGACT 17 CA TAA T
P43 AGAAA T 15 GCGA TT
GTGAAA 17 TAAAA T
SacB TTGCAA 17 TAGAA T consensus TTGACT 17 TA TAA T
枯草芽孢杆菌中的σ因子
σfactor Gene(s) Function -35 spa
cer
-10
σA(σ43,σ55) sigA,rpoD Housekeeping/earlysporul
ation
TTGACA 17 TA TAA T
σB(σ37)sigB General tress response RGGXTT
RA
14 GGGTA T
σC(σ32)unknown Postexponential
geneexpression AAA TC 15 TAXTGYTTZT
A
σD(σ28)sigD,flab Chemotaxis/autolysinflage
llar gene expression
TAAA 15 GCCGA TA T
σH(σ30)sigh,spoOH Postexponential
geneexpression;competen
ce andearly sporulation
genes RWAGGA
XXT
14 HGAA T
σL sigL Degradative enzyme
geneexpression
TGGCAC 15 TTGCANNN
σE(σ29)sigE,spoIIGB Early mother cell
geneexpression ZHA TAX
X
14 CA TACAHT
σ
F(σSPOIIAC) sigF,spoIIAC Early forespore cell
geneexpression
ZHA TAX
X
15 CA TACAHT
σG sigG,spoIIIG Late forespore cell
geneexpression
GHA TR 18 GGHRARHTX
σK sigK,spoIVCB
:spoIIIC Late mother cell
geneexpression
AC 17 CA TANNNTA
其中H指A/C;N指A/G/C/T;R指A/G;W指A/G/C;X指A/T;Y指C/T;Z指T/G.
第一节：转录系统
枯草芽孢杆菌σA因子所识别的启动子-35区和-10区与大肠杆菌类似，保守序列分别为“TTGACA”和“TA TAA T”。

σA因子识别的启动子两区域之间的间距为17~18bp，而其他RNA聚合酶的则不定，多为15~16bp。

一般来说，当该距离偏离17bp，无论大或小时，启动子都会变弱。

在枯草芽孢杆菌中，许多启动子的-35区上游富含A T，该A T丰富区被称为转录增强区，对基因转录非常重要；在-10区的上游含有一个重要的TGTG基序（-16），这个区域的突变会显著的减弱启动子的强。

另外，在-10区到+1之间通常也富含A T，该特点主要是便于转录起始时促进DNA的局部解链。

对很多依赖于σA因子的枯草芽胞杆菌的启动子的研究表明，它们带有规范的存在与大肠杆菌启动子中的-10和-35序列。

至少在枯草芽胞杆菌中，有很多启动子在-10区的上游都含有一个重要的TGTG基序（-16）。

这个区域的突变会显著的减弱启动子的强度。

上述启动子在-35区的上游还保留了很多的多聚A和多聚T的区域。

虽然这个-16区在大肠杆菌中发现，但是这样的启动子常常缺乏-35区，而在枯草芽胞杆菌中则有-35区。

迄今发现的枯草芽孢杆菌启动子主要有两种形式：一是单个的启动子，多数在快速生长期表达；另一类为复合启动子（最常见的例如P43），它包括串联启动子和重叠启动子。

重叠启动子有这样一些特征：（1）不同类型的两个启动子重叠；（2）两个启动子有不同的转录
起始位点或相同的起始位点；（3）启动子可能受时序调节。

这类启动子在枯草芽孢杆菌感知外界环境变化，孢子形成等诸多方面发挥着重要作用。

终止子：一旦RNA聚合酶起始了转录，就会不停的合成核酸直到遇到转录终止位点。

细菌DNA有两类转录终止位点：因子依赖型和非因子依赖型。

在枯草芽孢杆菌基因转录终止方面，仅有少数基因得到很好的研究。

它们的终止区都富含GC的倒转重复，后面跟着一串A(T)，即非因子依赖型的转录终止。

有资料显示，枯草芽孢杆菌的终止子在结构和序列上与大肠杆菌相似，并发现大肠杆菌的终止结构在枯草芽孢杆菌中同样起作用。

目前外源基因表达中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tφ。

对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。

终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。

第二节：翻译系统
1.枯草芽孢杆菌mRNA的核糖体结合位点（RBS），也称为SD序列。

其典型的SD 序列为“GGAGG”，与大肠杆菌的“AAGGA”有所不同。

一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。

对多数基因而言，上述4个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低。

2.核糖体的16S rRNA3’端参与识别mRNA并起始翻译，而枯草芽孢杆菌的16SrRNA 3’端序列与大肠杆菌是不相同的，枯草芽孢杆菌的核糖体只能识别同源的mRNA，大肠杆菌的核糖体可以支持革兰氏阳性和阴性菌的mRNA指导蛋白质合成。

因此，作为革兰氏阴性菌的大肠杆菌，其基因除个别的以外，一般的不能直接在属于革兰氏阳性菌的芽孢杆菌中表达，而芽孢杆菌的基因可以在大肠杆菌中表达。

注：这是因为革兰氏阳性菌的核糖体30S亚基缺少S1蛋白，这可能涉及到核糖体结合位点的问题，另外阴性菌的启动子枯草芽孢杆菌不能够识别。

SD序列与起始密码子之间的序列也影响翻译效率，通常富含A+T的间隔区比富含G+C 的翻译效率高15-50倍。

SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC 或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。

紧邻AUG的前三个碱基成分对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌β-半乳糖的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，酶的表达水平低20倍。

SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。

一般的，“GGAGG”的最后一个G和起始密码子的距离为7~9个碱基。

在此间隔少一个或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。

起始密码子在枯草芽孢杆菌中，多数基因的起始密码子为AUG，少数为GUG或UUG，AUG仍为起始密码子的最优选择。

大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG 和UUG三种起始密码子，但识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。

从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，这一序列不能与mRNA 的5’端非编码区形成茎环结构，否则会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。