萜皂苷类成分的抗衰老作用与质量分析研究课件

目前对天然药物的抗衰老作用，多从
其对免疫功能、神经系统、内分泌系统、
物质代谢、抗衰老自由基、延长细胞和动
物的寿命、抗肿瘤、强壮、延长生长期等
方面的作用来评价。
而不少皂甙具有上述作用，特别是三萜
皂甙的活性更显著。如人参、西洋参、三 七和绞股蓝等是常见具抗衰老作用的天然 药物。它们均富含三萜类达玛烷型皂甙。
ELSD已成功用于皂甙、生物碱、萜类内酯、氨基 酸和糖类等分析。是分析无紫外吸收及紫外吸收 弱成分的有力工具。
2. 流动相的选择
皂苷类成分多用反相色谱柱。
常用流动相有乙腈、甲醇、纯水等。 对溶剂要求较高，最好是色谱醇。
四. 三萜皂苷的质量分析研究
(一) 三七中三萜皂苷的定量分析
三七为五加科植物三七Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen的干燥根。功能散瘀止血， 消肿定痛。
一．三萜皂苷的研究概况
三萜皂甙是由六个异戊二烯以头尾相接或尾尾相接而 组成，一般由含30个碳原子。按其皂甙元，可将三萜皂甙 分为五环三萜(pentacylic triterpennoids)和四环三萜 (tetracylic triterpennoids)两大类。
五环三萜皂甙数目较多，又可分为七种类型：齐墩果 烷(oleanane)型、羽扇豆烷(ursane)型、木栓烷 (lupane)型、异B-香树脂醇(iso-B-amyrin)型、羊齿烷 (fernane)和异羊齿烷(isofernane)型、何帕烷(hopane) 和异何帕烷(isohopane)型。四环三萜皂甙除含有C30外， 也有C31或C32的衍生物，主要有四种类型：达玛烷 (dammarane)型、羊毛脂烷(lanostane)型、大戟烷 (euphane)型、葫芦烷(cucurbitane)型。
2. 可显著降低高脂饲养大鼠的血清甘油 三酯。
3. 酸枣仁皂苷B能增强N神经因子作用。
H. 龙牙楤木皂苷 1. 可使小鼠游泳时间显著延长，增强小
鼠耐缺氧、抗低温作用。
2. 对KCN、NaNO2引起的中毒性缺氧小 鼠有保护作用。
I．大豆皂苷
1. 对链脲霉素所致糖尼尿病大鼠可降低 血糖水平，提高SOD含量，降低脂质过氧 化物。
(3) 显色剂：25%磷钼酸乙醇溶液
硫酸：甲醇（1：1）
氯磺酸：醋酸（1：2）
碘蒸气
2. 含量测定方法： (1) 薄层-比色法
人参皂苷元的薄层-比色法测定
标准曲线：对照品为人参皂苷元（人参二醇、人参三醇、 齐墩果酸），加5%香草醛-冰醋酸、高氯酸；再加醋酸， 在560nm测定，做三条标准曲线
样品测定：硅胶G，条状点样；氯仿-甲醇-水(60:42:11
碘蒸气显色；刮取斑点范围硅胶，显色测定。测定三组 皂苷的吸收度，分别于标准曲线中查得相应数值，乘以 2.5、1.77与2.1倍，计算各组皂苷含量
(2) 薄层扫描法
A.人参单体皂苷薄层扫描法测定
样品制备：甲醇，冷浸-热回流
对照：人参皂苷Ro、Rb1、Rb2、RC、Rd、Re、Rg1、Rg2 扫描条件：λs=525nm，λR=760nm；投射法线性 样品测定：GF254板，
（如硫酸、盐酸）加热水解，得皂苷元。 2．将样品先行水解，再用有机溶剂从水解的混合
液中提取皂苷元。 测定：主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和
比色法。
单体皂苷测定：主要为薄层色谱法和高效液相色 谱法。
(一) 比色法
皂苷类成分多无色，且常无紫外吸收。 含量测定时常需显色， 产生颜色---于可见光区比色测定 在紫外光区产生吸收---用紫外分光光度
含三萜皂甙的植物较少见，仅见于禾本科的少数
属；裸子植物及低等植物中也较少含有这类皂甙；
另外在海洋生物如海参、海星、海盘车等中亦有
存在。
许多常见中药中含三萜皂甙，如人参、三七、 甘草、西洋参、地榆、款冬花、酸枣仁、紫菀、 桔梗、柴胡、远志、黄芪、威灵仙、商陆、白头 翁等。
皂甙类成分具多种生理活性，如刺激黏膜， 已往常用作祛痰药，如桔梗、远志、紫菀中的皂 甙等。经研究发现三萜皂甙还具有促进核酸蛋白 质合成和胆固醇脂代谢、抗炎、抗菌、抑制肿瘤、 抗溃疡、兴奋或抑制中枢神经、抑制胃液分泌以 及杀死精子、软体动物等作用。
6. 能促进DNA、RNA、蛋白质和脂肪酸 的合成，使白蛋白和丙种球蛋白的含量增 加。
7. 对肾上腺素高血糖的抑制作用较强。 并显示对动物血糖水平有双向调节作用。
8. 可明显抑制中、老年大、小鼠的脂质 过氧化作用。可延长细胞生长天数。
B. 三七皂苷
1. 可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞 噬指数。
单体皂苷测定
总皂苷测定：
1. 提取：一般需要适当的溶剂提取。
由于皂苷在极性溶剂中溶解度较大，提取
溶剂可为各种浓度的甲醇、乙醇和异丙醇、
丁醇、戊醇。
2. 精制：水Baidu Nhomakorabea和的正丁醇萃取；大孔
树脂处理后溶剂洗脱。
3. 测定：最常用的方法为比色法，也
有用重量法的。
皂苷元测定： 提取：1．先用上述方法得到总皂苷，再加酸
蒸发光散射检测器（ELSD）是一种通用型检测器， 流动相由热气流使之热气化喷雾，再进入加热管， 溶剂在此挥发。所得分析检测的物质颗粒通过一 狭窄光束散射光，由光电倍增管收集。ELSD的响 应取决于被分析物质颗粒的数量和大小。由于 ELSD仅对不挥发被分析物质产生响应，即使是在 梯度洗脱时也能提供平稳的基线。
C. 西洋参皂苷
1. 能降低ACTH引起的小鼠胸腺及脾脏的 萎缩。
2. 可增强机体对缺氧的耐受力，延长小 鼠负重游泳时间。
D． 绞股蓝皂苷
1. 能明显提高小鼠游泳的体力和耐力，并咳提高常压缺 氧的耐受力。
2. 能促进小鼠生长发育，增强小鼠耐高温、抗疲劳的作 用。
3. 能预防地塞米松引起的肾上腺皮质激素、血浆皮质醇 减少。
（30:40:15:25，下层）
(三) 高效液相色谱法
关键问题是测定条件和流动相的选择。 1. 测定条件选择 多无共轭体系（少数除外），通常利用末
端吸收作为测定波长。 也可用示差折光检测器； 新近用蒸发光散射检测器（Evaporative
light scattering detector，ELSD）
现代药理研究证明，三七中皂甙类成分为其活性 成分。为了更好地对三七药材进行质量评价和制 定更完善的控制指标，采用HPLC-ELSD对其主 要皂甙人参皂甙Rg1、三七皂甙R1进行了含量测 定，并用紫外分光光度法测定了总皂甙的含量。
三七中皂甙类成分的含量测定可采用HPLC-UV及 HPLC-RI法。前者用紫外检测器=203nm检测， 因三七中皂甙类成分紫外吸收较差，受试剂影响 很大，基线漂移大，使分析很难进行。后者用示 差检测器，则灵敏度低，稳定性和选择性均较差。 本文用ELSD检测器测定三七中主要皂甙人参皂甙 Rg1的含量，因ELSD检测器为质量型检测器，且 不受外部环境的干扰，试剂在检测器中全部蒸发， 不干扰检测，灵敏度及稳定性均符合含量测定的 要求。
A．三七中总皂苷的含量测定
1．供试品溶液的制备： 取本品粉末约0.5g，精密称定，置索氏提取
器中，加乙醚80ml，置水浴上提取2h，弃去乙 醚液，再加甲醇80ml提取4h，甲醇提取液蒸干， 残渣加水15ml使溶解，水溶液置分液漏斗中，用 水饱和的正丁醇萃取5次，每次15ml，正丁醇液 蒸干，残渣加甲醇溶解，定溶至50ml，作为供试 品溶液。对照品溶液为人参皂甙Rg1 （5mg/100ml）。
A. 人参皂苷 1. 有网状内皮系统吞噬功能激活效果；对
特异性和非特异性免疫功能有刺激作用。 2. 可提高小鼠对常压、低压缺氧的耐力，
并可延长常温、高温负荷下游泳时间。 3. 有中枢兴奋作用，能激发人学习和记忆
能力，增减智力和操作能力。 4. 具有兴奋垂体-肾上腺皮质功能的作用
5. 有性腺激素样作用；有雄性激素样作 用，能使小鼠精囊腺增重。
2. 黄芪甲苷、绵毛黄芪苷均可对抗CCl4 所致的小鼠死亡；使小鼠红细胞内SOD活 性升高。
F．商陆皂苷
1. 商陆皂苷甲可显著减少羊红细胞致敏 血清溶血素的含量。
2. 商陆总皂苷有对抗羟基脲所致小鼠体 重下降、耐寒力低下的作用。
G．酸枣仁皂苷
1. 酸枣仁总皂苷能显著降低正常大鼠血 清胆固醇和LDL-C，显著升高HDL-C。
三萜皂甙在植物界有较广泛的分布，据报道 在104科1730种植物中，含有皂甙的植物就约有 79 科860 种，其中含有三萜皂甙的植物就约有 627 种。
三萜皂甙在双子叶植物中分布较为普遍，较
多种的科有五加科、伞形科、夹竹桃科、菊科、
石斛科、葫芦科、大戟科、豆科、桃金娘科、远
志科、毛莨科、蔷嶶科、茜草科等；单子叶植物
达玛烷型皂甙除了上述活性外，在血
压、血糖等项指标上，还具有明显的双向
调节作用。这一种特性对抗衰老药物来说
颇为有益的，它可使发病失去某种平衡的
机体恢复新的动态平衡，所以这类成分的
研究倍受关注。
另外报道在约6科28种植物含有达玛烷 型皂甙，从中寻找出有效的抗衰老药物是 完全可能的。
二．三萜皂苷抗衰老作用
法测定。 皂苷类成分的颜色反应的专属性虽较差，
但反应比较灵敏，方法简便，易行。
常用的显色剂有：
浓硫酸
高氯酸
硫酸-醋酐、硫酸-醋酐-冰醋酸或硫酸冰醋酸
芳香醛-硫酸或芳香醛-高氯酸 其它试剂：对-二甲氨基苯甲醛，亚甲蓝
等
(二) 薄层色谱法
1. 薄层条件
(1) 吸附剂：硅胶，氧化铝
(2) 展开剂：皂苷；皂苷元
2. 对未成年小鼠体重增加有明显促进作用；可 增强小鼠耐高、低温能力。
3. 能显著降低老年大鼠脑组织脂褐质及血清过 氧化脂质总含量。
4. 有雄性激素样作用，能使小鼠精囊腺增重。 5. 有促进小鼠肝、肾DNA及血清蛋白质合成的
作用。 6. 可明显抑制中、老年大、小鼠的脂质过氧化
作用。 7. 总皂苷抗血栓。
2. 对预防高脂肪食物造成的高脂血症有 作用。
3. 有降低抗肿瘤抗生素阿霉素所致心肌 中过氧化脂质的上升。
K．独一味皂苷
1. 能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬 率和吞噬指数、E-花环形成率及酯酶染色 阳性率。
2. 对Hepa、EC瘤株均有一定的抑制作用。
L．土贝母皂苷
1. 能抑制人体早幼粒细胞白血病细胞 （HL60）的生长。
2．紫外吸收光谱：
仪器为岛津UV-2501pc紫外分光光度 计；供试品紫外吸收曲线及最大吸收波长 268nm与人参皂甙Rg1标准品完全一致
3．标准曲线制备：
分别精密吸取对照品溶液0.0，1.0，2.0， 3.0，4.0，5.0ml置10ml量瓶中，置水浴中挥尽 溶剂，取出，加浓硫酸0.6ml，摇匀，置80℃水 浴中加热1h，取出，置冰浴中加95%乙醇至刻度， 摇匀，在268nm波长处测定吸收度。 以吸收度 为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。经回 归统计，得标准曲线方程： A=39.6856C+0.0148，r=0.9996。
显色剂为10%硫酸，115℃，10min
氯仿-甲醇-水（13:7:2）测定Ro、Rb1、Rg1、Rg2 正丁醇-醋酸乙酯-水（4:1:1）测定Rb2、RC、Rd、Re
B.三七中皂苷薄层扫描法测定
对照品：三七皂苷C1、D1、D2、E 扫描条件：λs=525nm，λR=700nm；反射法线性 样品测定：硅胶G板，显色剂为碳酸氢钠-无水乙醇 展开剂为1，2-二氯乙烷-正丁醇-甲醇-水
浓度在5.04-25.20μg/ml范围内，与吸收度呈线 性关系。
4. 可预防地塞米松引起的胸腺萎缩。 5. 对喂高蔗糖、高脂的大鼠所致的高脂血症有效。 6. 能增加自由基损伤模型大鼠和老年大鼠红细胞中
SOD的活力。 7. 对肝、子宫、肺等癌细胞增生的抑制率为20%-
80%；对S180有明显的抑制作用。
E． 黄芪皂苷
1. 黄芪甲苷有促进B细胞增生、分化和浆 细胞抗体合成作用。
2. 可使酵母多糖微粒的吞噬功能明显增 加。
M．柴胡皂苷
1. 柴胡总皂苷可促进大鼠促肾上腺皮质 激素、皮质酮的分泌。
2. 柴胡皂苷d对小鼠艾氏腹水癌有抑制肿 瘤生长作用，且能明显延长动物的生存时 间。
三. 三萜皂苷的主要含量分析方法
中药及其制剂中三萜皂苷的含量分析可 分为:
总皂苷测定
皂苷元测定