髓核细胞移植抑制椎间盘退变

中国组织工程研究 第17卷 第53期 2013–12–31出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 31, 2013 Vol.17, No.53
doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.53.023 []
王春生，张维斌. 髓核细胞移植抑制椎间盘退变[J].中国组织工程研究，2013，17(53):9239-9244.
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
9239 www.
CRTER .org
王春生★，男，1972年生，辽宁省沈阳市人，汉族，1992年解放军第四军医大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事椎间盘突出等软伤疾病方面的研究。

ruige123@
中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2013)53-09239-06
修回日期：2013-11-13 (201304161/LYL 〃W)
Wang Chun-sheng ★, Master, Associate chief physician, Department of Soft Tissue Injury, Beiling Branch, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110031, Liaoning Province, China ruige123@
Accepted: 2013-11-13
髓核细胞移植抑制椎间盘退变★
王春生，张维斌(解放军沈阳军区总医院北陵临床部软伤科，辽宁省沈阳市 110031)
文章亮点：
1 此问题的已知信息：目前，对于椎间盘退变的治疗主要以减轻疼痛为主，并不是从修复变性椎间盘细胞的方面来治疗，解决椎间盘退变可以向椎间盘内补充足够量的具有生物学活性的髓核细胞来治疗，促进椎间盘细胞外基质的合成。

2 文章增加的新信息：椎间盘退变移植的细胞主要有软骨细胞、髓核细胞和骨髓基质干细胞，只有髓核细胞移植是可行的，由于髓核细胞培养困难，获得细胞的数量有限，改进髓核细胞培养的方法可以使培养髓核细胞数量得到有效扩增。

3 临床应用的意义：在临床治疗上，髓核细胞移植治疗椎间盘退变还处于初级阶段，但未来具有广阔的应用和发展前景。

关键词：
器官移植；器官移植学术探讨；细胞移植；髓核细胞；椎间盘；椎间盘退变；细胞培养；纤维环；细胞外基质；胶原；蛋白聚糖 主题词：
细胞移植；椎间盘；椎间盘退化；细胞外基质；胶原Ⅱ型；蛋白聚糖类
摘要
背景：近年来，椎间盘细胞移植和椎间盘移植修复椎间盘退变研究取得较大的进展。

目的：探讨髓核细胞的体外培养方法以及髓核细胞移植在抑制椎间盘退变研究中的作用。

方法：通过数据库检索的方式探讨髓核细胞移植抑制椎间盘退变的研究。

髓核细胞的主要功能是产生胶原和蛋白聚糖，改进髓核细胞的培养方法，使培养后的髓核细胞数量增多，合成和分泌细胞外基质增加，通过髓核细胞移植来修复退变的椎间盘。

结果与结论：通过三维小球聚集培养、微载体旋转立体培养等方法可以使髓核细胞数量增多，肝细胞生长因子对髓核细胞增殖产生促进作用。

髓核细胞移植可以恢复退变椎间盘高度，促进退变椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成和分泌。

随着对椎间盘退变研究的不断深入，髓核细胞移植对退变椎间盘可能是一种重要的治疗手段。

Nucleus pulposus cell transplantation inhibits intervertebral disk degeneration
Wang Chun-sheng, Zhang Wei-bin (Department of Soft Tissue Injury, Beiling Branch, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110031, Liaoning Province, China)
Abstract
BACKGROUND: In recent years, cell transplantation and intervertebral disk grafting for intervertebral disk degeneration have been greatly developed.
OBJECTIVE: To investigate the in vitro culture methods of nucleus pulposus cells and effects of nucleus pulposus cell transplantation on intervertebral disk degeneration.
METHODS: A computer-based search of databases was performed to explore the effects of nucleus pulposus cell transplantation on intervertebral disk degeneration. The main function of the nucleus pulposus cells is to produce collagen and proteoglycans. Through improvement of culture methods, the number of nucleus pulposus cells increased, and matrix synthesis and secretion also increased. Therefore, the nucleus pulposus cell transplantation was able to repair the degenerated intervertebral disk.
RESULTS AND CONCLUSION: The three-dimensional aggregation culture method and three-dimensional microcarrier rotation method elicit the increase in the number of nucleus pulposus cells, and hepatocyte growth factor also can produce a catalytic role in the proliferation of nucleus pulposus cells. Nucleus pulposus cell transplantation can restore degenerative disc height, and promote the biosynthesis and secretion of
proteoglycans and type Ⅱ collagen in the degenerated intervertebral disk. With the deepening of intervertebral disk research, nucleus pulposus cell transplantation may become an important therapeutic tool for intervertebral disk degeneration.
Subject headings: cell transplantation; intervertebral disk; intervertebral disk degeneration; extracellular matrix; collagen type Ⅱ; proteoglycans
Wang CS, Zhang WB. Nucleus pulposus cell transplantation inhibits intervertebral disk degeneration. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(53):9239-9244.
0 引言Introduction
椎间盘退变是造成腰背痛的主要病因[1]，可引起腰椎管狭窄、腰椎间盘突出症、节段性腰椎不稳定和退变性腰椎滑脱等一系列疾病[2]。

大多数腰椎间盘突出症等患者接受保守治疗，只有一部分患者接受外科手术治疗。

椎间盘退变的发病机制尚不清楚，大多认为是由于机械诱导、生物介导、营养代谢失衡等多种因素所引起[3-5]。

髓核细胞的主要功能是产生胶原和蛋白聚糖[6]。

髓核是椎间盘行使功能的中心，髓核的系统性变化可能是椎间盘病理性变化的基本原因。

研究表明椎间盘的退变始于髓核。

椎间盘退变首先的形态学变化是部分软骨终板从邻近椎体的分离。

在退变的髓核中，细胞出现退变，出现合体细胞和巨大细胞，细胞由软骨细胞变为成纤维细胞；组织坏死，玻璃样变以及纤维化；细胞基质颗粒样皱缩。

从而导致髓核内的细胞外基质合成减少[7]。

蛋白聚糖是椎间盘的主要大分子结构，是许多共价键连接于核心蛋白的糖胺多糖所组成的大分子家族，椎间盘中主要存在硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸3种糖胺多糖，是细胞外基质的一种重要成分，是椎间盘力学特征依赖的基础之一，与椎间盘退变关系密切[8-9]。

从椎间盘退变的病因来看，退变是由于髓核退变造成的，髓核的纤维化以及髓核内水分的丢失，都是可以导致应力传递能力的减退，因此，有效防止髓核细胞退变是恢复椎间盘结构和功能的较好方法[10]。

1 资料和方法Data and methods
资料来源：采用检索万方数据库和Pubmed数据库的方法获取资料[11-12]。

资料检索公式：检索的时间范围在1995至2013年，中文检索词为“髓核细胞；椎间盘退变；细胞培养；细胞外基质；胶原；蛋白聚糖”，英文检索词为“nucleus pulposus cells；intervertebral disc degeneration；cell culture；extracellular matrix；collagen；proteoglycans”，共检索出相关文献1 109篇。

其中，万方数据库的文献有259篇，Pubmed数据库的文献有850篇。

最终纳入结果分析的文献共18篇[13-30]。

入选标准：①检索结果中排除与研究目的不相关的文献。

②文献的内容与髓核细胞培养和髓核细胞移植抑制椎间盘退变研究相关。

③排除无全文的文献。

④同一研究团队以及同一作者的相似研究，只选取其中1篇纳入结果分析。

⑤检索的文献体例为论著和病例报告等，均为一次性的文献，排除综述类的二次性文献。

2髓核细胞培养以及髓核细胞移植抑制椎间盘退变的实验研究Experimental study on nucleus pulposus cell culture and transplantation against intervertebral disk degeneration
2.1 对髓核细胞分泌细胞外基质有促进作用的体外培养方法从椎间盘退变移植细胞的选择方面来看，主要有自体软骨细胞、自体髓核细胞和自体骨髓基质干细胞，但只有髓核细胞是可行的，但髓核细胞由于某种原因获得的数量有限以及培养困难等，阻碍了研究的进程。

近年来，关于改进髓核细胞培养方法的研究可以使细胞数量得到扩增。

2.1.1 多次胶原酶消化法培养髓核细胞张兴凯等[13]使用多次胶原酶消化的方法体外分离培养椎间盘髓核细胞，接种，传代，取第2代细胞，分别采用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应方法检测椎间盘髓核细胞特征性分泌物Ⅱ型胶原和聚合蛋白的分泌量及mRNA的表达，并与软骨细胞、成骨细胞及成纤维细胞进行比较，结果见表1。

2.1.2 三维小球聚集培养髓核细胞程洪涛[14]寻找合适的在体外培养髓核细胞的方法，获得质量和数量更良好的髓核细胞。

采用胰酶+胶原酶联合消化法分离兔髓核细胞，分离所获细胞一部分用DMEM/F12混合培养基进行单层培养，其余的采用低速离心，使其形成小球形聚集，并在聚丙烯离心管中进行培养。

三维小球聚集培养法是将髓核细胞悬液的细胞浓度调成5×108 L-1，取1 mL细胞悬液加入15 mL聚丙烯表1 张兴凯等[13]研究中各种细胞Ⅱ型胶原和聚合蛋白mRNA的表达(x_±s) 注：髓核细胞Ⅱ型胶原和聚合蛋白mRNA表达与软骨细胞相同，与成纤维细胞和成骨细胞存在明显差别。

说明多次胶原酶消化的方法可以获得大量纯净的椎间盘髓核细胞，性状稳定。

组别Ⅱ型胶原聚合蛋白
成纤维细胞组0 0
成骨细胞组0 0
软骨细胞组 1.48±0.22 1.11±0.14
髓核细胞组 1.52±0.23 1.21±0.13
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离心管中，补充培养液至5 mL ，用低温离心机以20×g 离心力4 ℃离心5 min ，使细胞聚集成团，放入CO 2恒温细胞培养箱中，体积分数为5%的CO 2在37 ℃恒温孵育，每2 d 换液1次。

两种方法在培养相同时间后，分别检测能够反映髓核细胞合成硫酸化蛋白聚糖能力的35S 摄取率来比较两种培养体系里髓核细胞的合成代谢能力。

在不同时间两种方法培养的髓核细胞35
S 摄取率，见表2。

2.1.3 微载体旋转立体培养髓核细胞 宁斌等[15]分
析成人退变髓核细胞的体外微载体旋转立体培养模式及其对细胞外基质合成的影响。

选取因椎间盘疾患行椎体间融合的患者，对34个退变的髓核组织进行体外培养，将其随机分为单层培养组和微载体旋转立体培养组。

微载体旋转立体培养取2.04 g 微载体颗粒，环氧乙烷灭菌后，5%的硅油预湿，将其放入旋转培养瓶，加入HAM F-12/DMEM+体积分数为10% FBS 培养液100 mL ，将旋转培养瓶臵于慢速磁力离心机上，10 r/min ，培养箱中预培养24 h 。

比较对数生长期髓核细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化结果和不同生长期细胞的蛋白多糖含量，见表3。

2.1.4 肝细胞生长因子对髓核细胞的作用 满孝旭等[16]研究肝细胞生长因子对体外培养人退变髓核细胞生物学活性的影响，应用免疫组织化学染色观察肝细胞生长因子受体在髓核细胞中的表达，并测不同浓
度肝细胞生长因子的细胞生长曲线，筛选最佳的作用浓度。

选取第3代髓核细胞，反转录聚合酶链反应检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 mRNA 表达。

四唑盐比色法结果提示不同浓度肝细胞生长因子对体外培养的人退变髓核细胞均有明显的促增殖作用，与对照组相比差异均有显著性意义，肝细胞生长因子刺激后髓核细胞进入增殖期比例增加，同时促进髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 mRNA 表达量增加，可以促进细胞外基质表达。

不同浓度肝细胞生长因子培养人退变髓核细胞的吸光度值结果，见表4。

2.2 髓核细胞移植抑制椎间盘退变的实验研究
2.2.1 髓核细胞移植对受损椎间盘退变的影响 磁共振是目前公认的椎间盘退变动物模型的无损伤性影像学检查方法[17]。

赵献峰等[18]比较髓核细胞移植和骨髓基质细胞移植对椎间盘退变的影响，采用原代细胞培养法获取并扩增髓核细胞及骨髓基质细胞，2岁龄新西兰白兔随机分为3组，盐水注射组3只，骨髓基质细胞移植组6只，髓核细胞移植组6只，在椎间盘进行髓核穿刺抽吸后分组注入盐水、骨髓基质细胞和髓核细胞，未处理的椎间盘作为对照组采集数据。

通过测量椎间盘高度指数和磁共振影像结果来分析细胞移植对椎间盘损伤退变的影响。

在移植后不同时间点各组椎间盘高度指数的动态变化，见表5。

表2 程洪涛[14]研究中在不同时间两种方法培养的髓核细胞
35
S 摄取率 (x _
±s ，%)
注：两种培养体系里的髓核细胞35 S 摄取率均随时间增加，但三维小球法
培养的髓核细胞35
S 摄取率高于单层培养的髓核细胞(P < 0.05)。

三维培养
的髓核细胞蛋白聚糖的合成能力高于单层培养的髓核细胞。

组别 6 h 12 h 18 h 24 h 单层细胞组
6.35±0.75 8.10±0.17 10.39±0.59 12.97±0.25 三维小球组
8.89±0.40
12.31±0.33
15.71±0.33
19.31±0.60
表3 宁斌等[15]研究不同培养方法下对数生长期髓核细胞Ⅰ、Ⅱ型
胶原免疫组化结果和不同生长期细胞的蛋白多糖含量
(x _
±s ，n =16)
注：微载体培养组Ⅰ、Ⅱ型胶原和表达蛋白多糖含量高于单层培养组，与单层培养组比较，a P < 0.01，b P < 0.05，c P < 0.05，d P < 0.01，可见，微
载体旋转立体培养法对成人退变髓核细胞基质内Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白多糖
的表达具有正向调控的作用，可以适用于成人退变髓核细胞的大量扩增。

项目 单层培养组 微载体培养组 t P
Ⅰ型胶原免疫组化
15.2±1.2 32.5±4.4a 2.871 0.008 Ⅱ型胶原免疫组化
23.1±2.2 43.6±4.1b 2.375 0.023 稳定生长期蛋白多糖含量 21 046±673 34 821±312c
2.134 0.047 对数生长期蛋白多糖含量
32 193±713
45 134±175d
2.801 0.009
表4 满孝旭等[16]研究中体积分数20%血清条件下加入不同浓度
肝细胞生长因子培养人退变髓核细胞的吸光度值 (x _
±s ) 注：与0 μg/L 组比较，a P < 0.05；与50 μg/L 组比较，b P < 0.05。

50 μg/L 是实验中肝细胞生长因子的最佳作用浓度。

组别 第3天 第5天 0 μg/L 组 0.093±0.004 0.369±0.027 5 μg/L 组 0.102±0.006ab
0.479±0.019ab 50 μg/L 组 0.114±0.005a 0.592±0.040a 500 μg/L 组
0.105±0.006ab
0.474±0.086ab
表5 赵献峰等[18]研究中不同时间点各组椎间盘高度指数的动态
变化 (x _
±s ，%)
注：细胞移植组较盐水注射组均能有效抑制损伤椎间盘进行性的高度丢失、
骨性终板破坏、骨赘形成、细胞外基质丧失等。

髓核细胞移植组在移植后6
周的椎间盘高度指数与移植后8周比较，两者间差异有显著性意义(P < 0.05)。

提示移植后8周时髓核细胞移植组椎间盘高度恢复；且移植后8周时髓核细胞移植组与骨髓基质细胞移植组的椎间盘高度指数比较差异无显
著性意义。

组别
n
移植前
移植后4周 移植后6周 移植后8周
盐水注射组
9 99.53±3.72 61.32±4.42 58.21±2.96 60.65±3.91 骨髓基质细胞
移植组
18 99.43±4.15 70.43±2.22
74.22±1.49 75.55±3.14 髓核细胞移植组 18 97.20±2.00 82.16±2.72
74.31±2.59 79.29±2.53
对照组
45 99.32±3.93 97.63±1.72 100.34±3.19 97.85±2.25
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在不同时间点各组磁共振ST2WI 数据显示，第8周时髓核细胞移植组T2信号强度(70.63±7.60)%高于骨髓基质细胞移植组(54.32±7.92)%，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

提示髓核细胞移植组细胞外基质的合成可能超过骨髓基质细胞移植组。

可见，髓核细胞移植或骨髓基质细胞移植能够有效避免椎间盘损伤后发生的进行性退变过程。

而且，在8周后髓核细胞移植组较骨髓基质细胞移植组显示出更强的基质合成能力。

椎间盘高度及含水量出现恢复的迹象。

外源性髓核细胞移植能够良好的适应受体椎间盘环境，并发挥相应的细胞外基质分泌功能。

2.2.2 髓核细胞移植促进退变椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成 刘勇[19]在微创经皮CT 引导下穿刺椎间盘建立兔椎间盘退变模型，将60只新西兰大白兔分别用甲苯噻嗪注射液3 mg/kg 、克他命注射液40 mg/kg 肌肉注射麻醉后，兔取左侧卧位，腰背部正中及左侧穿刺区域备皮，以2.5%的碘伏消毒，选择椎间盘层面行CT 扫描以穿刺造模，行腰椎间盘CT 扫描，以定位穿刺椎间隙。

兔左后方腰背部为进针点，消毒后在CT 定位下，经皮以18G 的穿刺针由左后方穿刺腰间盘。

穿刺针尖接近纤维环时行CT 扫描，调整穿刺角度及深度，缓缓进针，刺入髓核后再次CT 扫描，以确定针尖位于髓核中央。

对兔椎间盘细胞进行培养，在体外转双基因，将腺相关病毒介导的结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶组织抑制因子1双基因体外联合转染兔椎间盘髓核细胞后，再将转基因髓核细胞移植于退变兔腰椎间盘内，通过免疫组织化学和反转录聚合酶链反应以及35
S 整合法检测髓核细胞移植对椎间盘退变的影响，观察不同时期椎间盘信号、椎间高度、Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成的变化。

发现在体外转双基因腺相关病毒介导的结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶组织抑制因子1髓核细胞移植可以延缓或逆转椎间盘的退变。

研究中的几项检测结果发现，见表6。

Ⅱ型胶原免疫组化染色，在髓核区随机选取10个
高倍视野行阳性细胞计数，计算阳性率，结果见表7。

2.2.3 转化生长因子β3基因修饰退变髓核细胞植入对退变椎间盘的影响 宋希元等[20]将重组腺病毒载体Ad -转化生长因子β3与第2代退变髓核细胞按10︰1比例混合培养转染为A 组，待细胞融合后传代，四唑盐比色法检测转染细胞增殖活性，Western blot 检测转化生长因子β3蛋白含量，免疫细胞化学染色观察对数生长期转染细胞Ⅱ型胶原染色阳性率；采用病毒空载体转染髓核细胞B 组和未经转染髓核细胞C 组作为对照。

通过针刺椎间盘制备退变模型。

A 组和B 组将
100 μL 浓度为1×108 L -1对应细胞悬液注射入退变椎间盘，C 组同法注入等量PBS 。

在不同时间取椎间盘行组织学观察，结果见表8。

表6 刘勇[19]
研究中对髓核细胞移植前后的检测
检测方法
正常表现 造模后表现
转基因髓核细胞 移植后表现
苏木精-伊红染色
正常椎间盘髓核内细胞外基质均匀，髓核细胞数量较多
退变髓核的细胞数量减少
髓核细胞数量逐渐增
加
Masson 染色 正常纤维环各层排列均匀，缝隙少
退变椎间盘纤维环各层间裂隙明显增多
纤维环各层间排列较均匀，间裂隙没有呈现进一步加重，部分有所减轻
Safranine 0染色
正常髓核内蛋白多糖表达较退变对照组多
较正常髓核内蛋白多糖表达少
椎间盘髓核内蛋白多糖表达较明显，数量有所增多
表7 刘勇[19]研究中各组Ⅱ型胶原表达阳性率比较 (x _
±s ，
n =10) 注：细胞移植组较盐水注射组均能有效抑制损伤椎间盘进行性的高度丢失、
骨性终板破坏、骨赘形成、细胞外基质丧失等。

髓核细胞移植组在移植后6周的椎间盘高度指数与移植后8周比较，两者间差异有显著性意义(P < 0.05)。

提示移植后8周时髓核细胞移植组椎间盘高度恢复；且移植后8周
时髓核细胞移植组与骨髓基质细胞移植组的椎间盘高度指数比较差异无显著性意义。

组别 移植后6周 移植后10周 移植后14周 空白对照组
0.863±0.012 0.731±0.112 0.653±0.095 退变对照组
0.611±0.067 0.487±0.087 0.365±0.071 转基因髓核细胞移植组 0.849±0.007
0.753±0.092
0.626±0.012
表8
宋希元等[20]研究中检测各时间点各组Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA 表达 (x _
±s ) 注：与转化生长因子β3转染组比较，a P < 0.05；与空载体转染组比较， b
P < 0.05。

转化生长因子β3基因修饰退变髓核细胞后可明显改善细胞生物
活性，转染后髓核细胞植入兔体内可明显增加退变椎间盘的基质分泌。

组别
Ⅱ型胶原 6周 10周 14周
转化生长因子β3转染组(n =4) 空载体转染组(n =4)
未转染对照组(n =2)
F P
0.978±0.036b
0.787±0.133a 0.819±0.109a
10.171 0.005
1.138±0.078b
0.917±0.027a 0.946±0.107a 23.696 0.000
1.423±0.119b 1.072±0.068a 1.106±0.102a
38.516 0.000 组别
蛋白多糖 6周 10周 14周
转化生长因子β3转染组(n =4)
空载体转染组(n =4) 未转染对照组(n =2)
F P
0.903±0.034b
0.614±0.185a 0.575±0.066a
24.238 0.000
1.219±0.018b
0.896±0.167a 0.886±0.137a
22.915 0.000
1.418±0.031b 1.114±0.192a 1.099±0.108a
19.641 0.000
0.000
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3 讨论 Discussion
椎间盘由软骨板、纤维环和髓核组成，上下有软骨板，是透明软骨覆盖于椎体上，下面骺环中间的骨面，上下的软骨板与纤维环一起将髓核密封起来。

纤维环由胶原纤维束的纤维软骨构成，位于髓核的四周。

椎间盘具有液体泵的作用，可以通过促进体液渗透，从而给椎间盘提供营养和代谢废物，还可以在生物力学方面起重要作用，髓核纤维环可以分担椎体的压力负荷。

髓核是一种弹性胶状物质，被纤维环和软骨板所包绕。

髓核中含有黏多糖蛋白复合体、硫酸软骨素和大量水分。

髓核细胞属于已分化细胞，适应在椎间盘内高压、乏营养、偏酸的特殊环境。

正常成年人椎间盘细胞含量虽然很少，仅占椎间盘组织容积的1%，但对平衡椎间盘基质合成的表达和代谢更新起着重要作用。

椎间盘退变的移植细胞主要有软骨细胞、髓核细胞和骨髓基质干细胞等。

骨髓基质干细胞是具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞，在适当的诱导条件下可以促使细胞的分化，骨髓基质干细胞获取比较容易，自体来源的细胞无抗原性，易于外源性基因的导入和表达，是椎间盘细胞移植的重要细胞来源之一[21]，但目前还缺乏在椎间盘退变研究方面更深入的了解。

只有髓核细胞是可行的，文章中介绍的改进髓核细胞培养的方法可以使细胞数量得到扩增。

另外，永生化髓核细胞系的研究和建立加快了髓核细胞移植的进展[22]。

髓核细胞作为种子细胞移植治疗椎间盘退变是研究的热点问题，近年来，有很多深入的研究成果。

Matsuzaki [23]取杂交成年犬椎间盘连带其上下软骨终板放入在4 ℃体积分数为10%的二甲基亚砜浸泡1 h ，然后分别在-80 ℃和-196 ℃冷冻保存达1-24周时，分别复苏并进行移植试验，发现椎间盘移植有助于维持椎间盘高度。

Okuma 等[24]用自体髓核细胞移植到兔椎间盘退变的模型，免疫组织化学方法检测发现Ⅱ型胶原的表达多于未移植髓核细胞组，Ⅱ型
胶原含量明显增多。

Nomura 等[25]
先将兔椎间盘退变模型中髓核吸出，然后再将同种异体髓核细胞植入其中，在移植后16周检测发现髓核细胞移植组比未移植组Ⅱ型胶原含量有所增加。

Watanabe 等[26]在体外将髓核细胞和纤维环细胞共同培养后植入动物模型的退变椎间盘中，发现髓核细胞和纤维环细胞共同移植可以延缓或逆转椎间盘的退变。

Ganey 等[27]通过穿刺法获得犬髓核和纤维环细胞，在体外培养12周后移植到髓核内，在移植后发现椎间高度得到
维持，移植的细胞可以存活的较好，而且还有分化和分泌能力，产生正常的细胞外基质。

有研究发现腰椎髓核细胞比颈段和胸段椎体髓核细胞生长状态好，而且更适宜作为细胞培养的种子细胞[28]。

马凯歌等[29]研究自噬参与压力诱导兔髓核细胞退变。

在1 MPa 压力条件下培养髓核细胞12，24，48 h 。

发现在压力导致细胞衰老及死亡，自噬参与压力诱导细胞退变的过程，为压力诱导椎间盘髓核细胞退变的机制和防治提供新的内容和途径。

陶海鹰等[30]观察羧甲基壳聚糖对体外培养大鼠椎间盘髓核细胞细胞周期进程、细胞周期蛋白表达以及分泌细胞外基质的影响。

使用酶消化法提取大鼠椎间盘髓核细胞并进行体外培养，Ⅱ型胶原免疫组织化学鉴定髓核细胞。

发现羧甲基壳聚糖对体外培养髓核细胞增殖相关蛋白增殖细胞核抗原表达具有促进作用，促进细胞周期进程以及细胞周期蛋白表达，对髓核细胞分泌细胞外基质具有促进作用。

随着国内外专家对椎间盘退变研究的不断深入，未来髓核细胞移植对退变椎间盘可能是一种重要的治疗手段。

作者贡献：第一作者进行文章构思、实施、评估、资料收集、成文，第二作者对文章进行审校，第一作者对文章负责。

利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。

伦理要求：未涉及伦理冲突的内容。

学术术语：蛋白聚糖-是椎间盘的主要大分子结构，是许多共价键连接于核心蛋白的糖胺多糖所组成的大分子家族，椎间盘中主要存在硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸3种糖胺多糖，是细胞外基质的一种重要成分，是椎间盘力学特征依赖的基础之一，与椎间盘退变关系密切。

作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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