浸渍冻结对调理草鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白特性的影响

浸渍冻结对调理草鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白特性的影响林婉玲;杨贤庆;李来好;王锦旭;黄卉;郝淑贤;吴燕燕;宋莹
【摘要】为了探讨浸渍冻结对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)冻藏过程蛋白质变性的影响,对蛋白质溶解性、巯基、Ca2+-ATPase活性、肌原纤维的降解及二级结构进行了研究.结果发现浸渍冻结的肌原纤维蛋白的溶解度、总巯基含量、活性巯基总量和Ca2+-ATPase的活性均比空气冻结的高,冻藏150 d后分别比空气冻结的高17.51％、14.20％、4.86％和28.73％.初步表明浸渍冻结更有利于减缓蛋白质变性.电泳结果表明,冻藏过程中浸渍冻结的肌球蛋白重链的电泳条带颜色比空气冻结的深,原肌球蛋白的电泳条带颜色比空气冻结的浅,说明浸渍冻结可减缓调理草鱼块蛋白质的降解.红外光谱的结果进一步发现浸渍冻结的肌原纤维蛋白的α-螺旋含量的下降程度较空气冻结的小,β-折叠、无规卷曲和β-转角含量的增加程度无空气冻结的明显.结果揭示了浸渍冻结更有利于维持冻藏过程中肌原纤维蛋白的二级结构.总的来说,浸渍冻结更有利于减轻蛋白质变性而引起调理草鱼块品质下降的问题.
【期刊名称】《南方水产科学》
【年(卷),期】2016(012)003
【总页数】7页(P67-73)
【关键词】调理草鱼;浸渍冻结;肌原纤维蛋白;冷冻变性
【作者】林婉玲;杨贤庆;李来好;王锦旭;黄卉;郝淑贤;吴燕燕;宋莹
【作者单位】中国水产科学研究院南海水产研究所,国家水产品加工技术研发中心,农业部水产品加工重点实验室,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研
究所,国家水产品加工技术研发中心,农业部水产品加工重点实验室,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,国家水产品加工技术研发中心,农业
部水产品加工重点实验室,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,
国家水产品加工技术研发中心,农业部水产品加工重点实验室,广东广州510300;中
国水产科学研究院南海水产研究所,国家水产品加工技术研发中心,农业部水产品加
工重点实验室,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,国家水产品
加工技术研发中心,农业部水产品加工重点实验室,广东广州510300;中国水产科学
研究院南海水产研究所,国家水产品加工技术研发中心,农业部水产品加工重点实验室,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,国家水产品加工技术研
发中心,农业部水产品加工重点实验室,广东广州510300
【正文语种】中文
【中图分类】S984.1
冷冻变性一直以来是影响水产品冻藏品质的主要因素之一，特别是淡水鱼的冻藏，冷冻变性对其品质的影响更加明显。

与海水鱼相比，淡水鱼的耐冻性效果更差，表现为巯基含量下降明显[1-2]、ATP酶活性的残留率下降[3-4]、肌原纤维蛋白的热稳定性较差、表面疏水性下降及二硫键含量增加较快[1]等，冷冻变性比海水鱼明显。

因此，如何降低淡水鱼在冻藏过程中冷冻变性的程度是目前淡水鱼加工研究的重点之一。

草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是中国产量较大的一种淡水鱼。

据统计，2013
年中国淡水鱼类总产量为2 647.9×104t，草鱼的总养殖产量为506.99×104t[5]，占淡水鱼总产量的19.1%，很受消费者喜欢。

但是草鱼水分质量分数较高(76%～83%)[6-8]，容易在冻藏过程中发生蛋白质变性而使品质下降[9]，因此，草鱼一般以鲜活销售为主，加工品种较少。

目前的产品主要有调理草鱼块、草鱼干制品、即
食草鱼片、香酥草鱼片、发酵草鱼片等[10-13]。

这种鲜销为主的模式严重地阻碍
了草鱼产业的发展。

因此，如何减轻草鱼在冻藏过程中冷冻变性程度，保持草鱼的品质，开发新的草鱼产品成为草鱼产业的研究热点。

在前期的研究中发现，浸渍冻结技术可显著地保持调理草鱼块在冻藏过程中的品质，这与浸渍冻结速度高有关，其冻结速率为空气冻结的9倍[9]。

但是，调理草鱼块冻藏过程中的蛋白质变性程
度以及如何发生改变却未见报道。

因此，为了进一步研究草鱼在冻藏过程中蛋白质的变性特征，阐述冷冻变性机理，文章以调理草鱼块为材料，研究其在冻藏过程中肌原纤维蛋白特性的变化特征，探讨不同的冻结技术对蛋白质特性的影响，为草鱼的产品开发以及减少冷冻变性对草鱼产品的影响提供理论依据，进一步促进草鱼产业的发展。

1.1 原料与试剂
1.1.1 主要原料新鲜草鱼，鱼体质量约3 kg，购于广州华润万家超市，鲜活运回实验室；食盐、白砂糖、生抽、白酒、姜和葱购于广州华润万家超市；甘草购于广州老百姓大药房。

1.1.2 主要试剂氯化钾、EDTA、酒石酸钾钠、SDS、氢氧化钠、无水硫酸铜、醋酸、甲醛、1-苯胺基-8-萘基磺酸、Tris、马来酸、甘氨酸、盐酸、十二烷基磺
酸钠、三羟甲基氨基甲烷、β-巯基乙醇等，均为分析纯；DTNB为优级纯；
Ca2+-ATP酶试剂盒、考马斯亮蓝测定试剂盒、考马斯亮蓝染色脱色液购于南京
建成生物工程研究所。

1.2 主要仪器设备
IKA T50高速匀浆机(德国艾卡仪器公司)；Sigma3K 30高速冷冻离心机(德国SIGMA仪器公司)；UV-3000(PC)紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；IRAffinity-1红外光谱仪(日本岛津SHINADZU有限公司)；Alpha1-4LSC型冷冻
干燥机(德国Christ公司)；SP2558型荧光光度仪(美国Ropera Scientific公司)；
PowerPacBasic 电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Tanon-1600凝胶成像系统(上海天能科技公司)；BCD-196T XZ冰箱(中国青岛海尔公司)。

1.3 实验方法
1.3.1 样品的制作及冻结将新鲜草鱼去鳞、去内脏、去腮和去头后用流动水
清洗干净，然后去骨，取背部肌肉，切片，最后将鱼片进行修整，修整后进行调理草鱼块的制作。

调理草鱼块的制作工艺采用杨贤庆等[10]的最佳工艺条件进行。

调理液由姜、葱、甘草熬制成混合液后与食盐、白砂糖、白酒、生抽和水混合而成。

将前处理好的鱼块放入调理液中腌制4 h，调理液的具体配比与工艺见杨贤庆等[10]。

将调理好的草鱼块真空包装后分别采用浸渍冻结和空气冻结。

浸渍冻结液温度为-40 ℃，冻至鱼块中心温度达到-18 ℃，停止冻结；空气冻结温度为-20 ℃，冻至鱼块中心温度达到-18 ℃，然后停止冻结。

所有样品放置-18 ℃条件下冻藏，样品层层叠放，并且每层用铁架网隔开，使样品冻藏温度均匀。

不同冻藏时间取出，每次取样3块，用搅拌机将3块样品搅碎，
混合均匀，然后进行各项指标的测定。

1.3.2 盐溶性蛋白的测定根据欧阳杰
等[14]的方法进行。

称取调理草鱼块混合肉4 g左右，搅碎后置于离心管中，加入40 mL 0.6 mol·L-1的KCl(pH 7.0)，冰水浴条件机械匀浆，然后在5 000 g、4 ℃下冷冻离心30 min。

收集完上清液之后，往沉淀中加入120 mL的冷却蒸馏水，然后在5 000 g、4 ℃下冷冻离心20 min，收集上清液。

重复上面操作一次。

最
后将所有上清液转移到100 mL的容量瓶中，用1.2 mol·L-1的KCl(pH 7.0)定容
至100 mL，用考马斯亮蓝法测定蛋白质质量浓度。

1.3.3 肌原纤维蛋白的制备根据邹明辉[15]的方法进行。

称取调理草鱼块混
合肉5 g左右，加入10倍体积20 mmol·L-1的Tris-maleate缓冲液(含0.05 mol·L-1的KCl，pH 7.0)，充分匀浆后在9 000 g、4 ℃条件下离心10 min，取
沉淀，重复洗涤2次。

向沉淀中加入10倍体积20 mmol·L-1的Tris-maleate缓
冲液(含0.06 mol·L-1的KCl，pH 7.0)，充分匀浆。

最后将所得肌原纤维蛋白溶
液在0.6 mmol·L-1的KCl缓冲液(pH 7.0)中透析24 h，然后在20 000 r·min-1、4 ℃下离心20 min，取上清液备用。

1.3.4 肌原纤维蛋白总巯基和活性巯基含量的测定根据邹明辉[15]方法进行。

总巯基含量测定：量取0.5 mL 1.3.3步骤所得的肌原纤维蛋白溶液，加入4.5 mL 0.2 mol·L-1的Tris-HCl溶液(含2%的SDS和10 mmol·L-1的EDTA，pH 6.8)
和0.5 mL 0.2 mol·L-1的Tris-HCl溶液(含0.1%的DTNB，pH 8.0)，混匀后置于40 ℃条件下发色25 min，最后在412 nm处测定各管吸光度值，同时以0.6 mol·L-1的KCl缓冲溶液做空白实验。

活性巯基含量测定：量取0.5 mL 1.3.3步骤所得的肌原纤维蛋白溶液，加入4.5 mL 0.2 mol·L-1的Tris-HCl溶液(pH 6.8)和0.5 mL 0.2 mol·L-1的Tris-HCl溶
液(含0.1%的DTNB，pH 8.0)，混匀后置于40 ℃条件下发色25 min，最后在412 nm处测定各管吸光度值，同时以0.6 mol·L-1的KCl缓冲溶液做空白实验。

巯基含量计算公式：SH(mol·L-1)=A×D/ξ×C
其中A为412 nm处的吸光值；D为稀释倍数；ξ为分子吸光系数13 600 L·(mol·cm)-1；C为蛋白质质量浓度(mg·mL-1)。

1.3.5 肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性的测定根据吴燕燕等[16]的方法进行。

称取调理草鱼块混合肉10 g左右，加入温度为4 ℃的生理盐水90 mL，然后在冰水浴条件下进行匀浆。

匀浆后在2 500 r·min-1、4 ℃的条件下离心10 min。

取上清液用4 ℃的生理盐水稀释成1%组织匀浆，按Ca2+-ATPase测定试剂盒说明书进行测定，详见南京建成生物工程研究所。

1.3.6 肌肉蛋白的SDS-PAGE 根据邹明辉[15]的方法进行。

称取一定量的调
理草鱼块混合肉，然后添加10倍量的5% SDS，充分匀浆后置于85 ℃恒温水浴
1 h，使蛋白质全部溶解，然后在3 500 g下离心10 min。

取上清液，即为电泳
样品。

将1 mL电泳样品与1 mL缓冲液混合均匀后，在100 ℃沸水中加热5 min，取出冷却后加样4 μL。

浓缩胶质量分数为4%，分离胶质量分数为10%，电极缓
冲液采用SDS-Tris-甘氨酸系统，以100 V恒压电泳直至溴酚蓝前沿离开凝胶下端底部时结束，电泳结束后用0.1%的考马斯亮兰(R-250)对凝胶染色，1 h后更换为脱色液，在摇床中脱色24 h后观察、拍照。

1.3.7 肌原纤维蛋白红外光谱的测定将提取的肌原纤维蛋白溶液放入-80 ℃
冰箱中冻结3 h，然后置于真空冷冻干燥机中干燥12 h即得到肌原纤维蛋白冻干
样品。

采用压片法，取肌原纤维蛋白冻干样品约3 mg与200 mg干燥的溴化钾
置于玛瑙研钵中，研磨均匀成粉末状，装样，手动压片。

测定条件为扫描次数24次，分辨率为4 cm-1。

最后采用Peakfit 4.12软件对所得的图谱进行去卷积和曲线拟合分析。

1.4 数据分析与处理
所有数据均进行统计分析，结果以平均值±标准差±SD)表示。

另外，采用t-test
和Pearson进行显著性和差异性分析。

2.1 盐溶性蛋白的变化
鱼肉蛋白质的功能特性主要由鱼肉中的肌原纤维蛋白所决定，其溶解性是肌肉在冻藏过程中蛋白质冷冻变性程度的主要指标之一。

随着冻藏时间的延长，鱼肉蛋白质变性程度增强，肌原纤维蛋白的溶解度降低，由此盐溶性蛋白的质量分数也逐渐减少。

新鲜草鱼中的盐溶性蛋白质量分数为95 mg·g-1左右，随着冻藏时间的增加，2种冻结方式下的调理草鱼块的盐溶性蛋白质量分数均不断减少，其中空气冻结的盐溶性蛋白在冻藏前60 d内下降较快，比浸渍冻结的低22.43%；整个冻藏期间
空气冻结的盐溶性蛋白质量分数始终低于浸渍冻结的，冻藏180 d后浸渍冻结的
盐溶性蛋白质量分数约为62 mg·g-1，而空气冻结的约为52 mg·g-1，比浸渍冻
结的低12.71%，并且在冻藏过程中，2种冻结方式的盐溶性蛋白质量分数具有显
著性差异(P<0.05)(图1-a)。

在冻结过程中，鱼肉中蛋白质的结合水形成冰晶，导致蛋白质之间形成非共价键，形成超大分子的不溶性的凝集体[17]，从而使蛋白质的溶解度下降。

在前期的研究中，调理草鱼块浸渍冻结的冻结速率远远高于采用空气冻结的，所以使冻结过程中鱼肉体内形成的冰晶小，形成超大分子的不溶性的凝集体也相对较少，蛋白质的溶解性也相对增多。

由此初步证明浸渍冻结更有效地降低了冻藏期间调理草鱼块的蛋白质变性程度。

2.2 肌原纤维蛋白巯基和活性巯基含量的变化
巯基是鱼肉蛋白质中最能反映活性的官能团，对稳定鱼肉肌原纤维蛋白的空间结构发挥重要作用。

随着冻藏时间的延长，2种冻结方式下调理草鱼块的肌原纤维蛋白总巯基含量不断下降(图1-b)。

其中浸渍冻结的肌原纤维蛋白总巯基含量在冻藏前60 d内下降较快，下降了32.41%；空气冻结的肌原纤维蛋白总巯基含量在冻藏前30 d内快速减少，减少了36.57%。

冻藏180 d后，浸渍冻结和空气冻结的分别比新鲜的下降了53.46%和56.51%，空气冻结的总巯基含量始终低于浸渍冻结的，比其低7.01%。

在整个冻藏过程中，2种冻结方式的草鱼的总巯基含量均具有显著性差异(P<0.05)，结果初步说明浸渍冻结有利于减少冻藏过程中蛋白质空间的改变。

随着冻藏时间的延长，2种冻结方式下的肌原纤维蛋白活性巯基含量均不断下降，下降趋势与总巯基的变化基本一致，且两者之间的差异性非常显著(P<0.001)(图1-c)。

其中浸渍冻结的调理草鱼块的肌原纤维蛋白活性巯基含量在整个冻藏期间下降速度基本平稳，空气冻结的调理草鱼块中肌原纤维蛋白活性巯基含量在冻藏前30 d内快速下降，比新鲜的下降了27.30%，而浸渍冻结的只下降了14.67%，且空气冻结的比浸渍冻结的低14.80%。

同时，整个冻藏过程中空气冻结的调理草鱼块中肌原纤维蛋白的活性巯基含量始终低于浸渍冻结。

鱼肉的功能特性及其理化性质主要取决于鱼肉肌纤维中的肌原纤维蛋白和肌动球蛋
白，而鱼肉肌动球蛋白结构的变化则会导致一系列功能性基团发生改变，如巯基基团和疏水基团[18]，巯基减少和二硫键的增加。

有研究认为,巯基含量的减少与盐
溶性蛋白的变化有关，冻藏过程中由于巯基氧化成为二硫键后，使鱼肉中肌球蛋白重链发生交联，由此使鱼肉蛋白质的盐溶性降低[19]。

结合图1-a,b,c，冻藏过程
中总巯基、活性巯基与盐溶性蛋白含量的变化均呈下降趋势，说明巯基含量降低导致盐溶性蛋白含量减少，结果进一步表明冻藏过程中草鱼的蛋白质变性与巯基含量的下降有关,浸渍冻结有利于减少冻藏过程中蛋白质空间的改变，减少蛋白质的冷
冻变性。

2.3 肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性的变化
鱼肉肌球蛋白中一般有42～43个巯基，其中活性巯基可分为SH1、SH2及SHα
三类。

SH1与SH2分布在鱼肉蛋白中肌球蛋白的头部，是鱼肉中肌球蛋白的
Ca2+-ATPase活性的表征[20]。

Ca2+-ATPase活性表征着鱼肉中肌球蛋白中球
状头部S-1的性征，根据鱼肉肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性大小可以判断鱼
肉中肌球蛋白的变性程度。

随着冻藏时间的延长，2种冻结方式下的调理草鱼块的Ca2+-ATPase活性不断下降，而空气冻结的Ca2+-ATPase活性始终低于浸渍冻结，且两者之间具有显著性差异(P<0.05)(图1-d)。

冻藏30 d后，空气冻结和浸
渍冻结的Ca2+-ATPase活性分别比新鲜的下降了37.89%和27.16%；冻藏120 d后，空气冻结的Ca2+-ATPase活性比浸渍冻结的下降了26.64%；冻藏180 d 后空气冻结的Ca2+-ATPase活性下降到6.13 U·mg-1，而浸渍冻结的为7.47 U·mg-1。

有研究发现，在冻藏过程中，位于鱼肉肌球蛋白中的轻质酶解肌球蛋白部分的巯基(SHα)促使了巯基氧化的进行，尤其是位于肌球蛋白头部区域巯基(SH1与SH2)的氧化则会进一步使鱼肉中肌原纤维蛋白的Ca2+-ATPase活性下降[21]。

在该研究中，草鱼肌肉蛋白中的巯基含量在冻藏过程中由于氧化而逐渐下降，并进一步使肌原纤维蛋白中的Ca2+-ATPase活性逐步下降，而浸渍冻结速度快，冻结
过程中形成的冰晶小，对肌肉蛋白质的结构损害更小，肌球蛋白中的疏水基团暴露更少，从而降低了巯基的氧化程度并使Ca2+-ATPase活性的下降程度更小，减少了蛋白质的冷冻变性程度。

2.4 肌肉蛋白的SDS-PAGE分析
前面研究已经证明了浸渍冻结更有利于减少草鱼在冻藏过程中冷冻变性程度，减少肌球蛋白分子受损。

随着冻藏时间的延长，鱼肉蛋白质的电泳条带发生明显改变，鱼肉蛋白质中肌球蛋白重链不断降解，肌动蛋白的量无明显变化，而小分子量的原肌球蛋白含量则不断增加(图2)。

通过对2种不同冻结方式对比分析可以发现，浸渍冻结的肌肉蛋白电泳图谱中肌球蛋白重链的条带颜色更深，说明其肌球蛋白重链的降解程度低于空气冻结，其小分子量的原肌球蛋白条带颜色的加深程度也不如空气冻结的明显。

这一实验结果表明浸渍冻结能够有效抑制冻藏过程中鱼肉肌球蛋白重链的降解，稳定鱼肉蛋白质的理化特性，降低鱼肉蛋白质冷冻变性的程度。

2.5 肌肉蛋白的红外光谱分析
鱼肉蛋白变性是指鱼肉蛋白质特定的空间构象在某些物理及化学因素作用下发生改变，进而使其理化性质发生改变，生物活性丧失的现象[22]。

在前面的研究中已经发现冻藏过程中肌原纤维蛋白发
生降解，从而使蛋白质发生变性，而浸渍冻结使冻藏过程中草鱼蛋白质的冷冻变性程度减弱。

为研究浸渍冻结如何维持蛋白质结构从而使变性程度减弱，采用红外光谱法对肌原纤维蛋白的二级结构进行分析。

红外光谱图中蛋白质和多肽在红外区一般有9个特征吸收带，其中波数范围在1 600～1 700 cm-1的酰胺I带，是蛋白质二级结构变化中吸收最强的区域，这一区域的变化是由蛋白质分子多肽骨架C=O键的伸缩振动引起的[23]，因此在蛋白质二级结构的研究中应用最广泛且最有价值。

在蛋白质的二级结构中，α-螺旋结构是蛋白质分子的有序结构，具有高度的结构稳定性；而β-转角和无规卷曲为蛋
白质分子的无序结构，因此可将α-螺旋结构的含量用于判断蛋白质结构的稳定性[24]。

冻藏期间2种冻结方式下的调理草鱼块中肌原纤维蛋白的α-螺旋含量均不断下降，β-折叠、无规卷曲、β-转角的含量则不断增加(图3)。

与新鲜样品对比，冻藏150 d后的浸渍冻结调理草鱼块的α-螺旋含量由44.83%降低到13.08%、β-折叠由14.86%增加到29.36%、无规卷曲由12.51%增加到17.9%、β-转角由27.79%增加到40.64%；空气冻结的调理草鱼块中肌原纤维蛋白的α-螺旋含量由44.83%降低到5.32%、β-折叠由14.86%增加到34.51%、无规卷曲由12.51%增加到
22.74%、β-转角由27.79%增加到44.42%。

结果表明，2种冻结方式的调理鱼块的蛋白质二级结构在冻藏过程中发生了明显的变化。

鱼肉蛋白质分子结构所呈现的这种由螺旋转向折叠，同时无规卷曲结构不断增加的趋势说明了在冻藏期间鱼肉肌原纤维蛋白分子构象不断从有序转化为无序，蛋白质二级结构逐渐被破坏。

随着冻藏时间的延长，鱼肉蛋白质的螺旋结构逐渐被破坏，解螺旋程度逐渐加大，说明蛋白质变性程度逐渐加重。

从2种冻结方式的二级结构结果来看，采用浸渍冻结的
鱼块的蛋白质的这种从有序转向无序的变化没有采用空气冻结的明显，说明采用浸渍冻结的调理草鱼块在冻藏过程中的冷冻变性程度没有采用空气冻结的严重，进一步证明了浸渍冻结比空气冻结更有利于维持冻藏期间鱼肉肌原纤维蛋白二级结构的稳定性。

调理草鱼经过浸渍冻结后，冻藏过程中肌原纤维蛋白的溶解度、总巯基含量、活性巯基总量和Ca2+-ATPase活性均比采用空气冻结的高，并且与空气冻结的有显著性差异(P<0.05)，说明浸渍冻结不仅能够有效抑制冻藏期间调理草鱼块的蛋白质
冷冻变性，防止肌球蛋白中巯基基团的暴露，而且通过抑制巯基的氧化，减少二硫键的生成，较好地保持了鱼肉蛋白质的功能特性及理化性质。

冻藏过程中浸渍冻结的调理草鱼块的肌球蛋白重链的条带颜色更深，降解程度低于
空气冻结的，原肌球蛋白条带颜色的加深程度也不如空气冻结的明显；肌原纤维蛋白的α-螺旋含量的下降，β-折叠、无规卷曲、β-转角等含量的增加程度没有空气冻结的明显，表明浸渍冻结能够有效抑制冻藏过程中鱼肉肌球蛋白重链的降解，更有利于维持鱼肉冻藏期间肌原纤维蛋白二级结构的稳定性，稳定鱼肉蛋白质的理化特性，从而降低草鱼蛋白质冷冻变性的程度。

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