0710009_微生物育种学课后习题答案

0710009_微⽣物育种学课后习题答案
《微⽣物遗传育种》复习思考题
01 绪论
1、⼯业微⽣物菌种应具有哪些基本特征？
①纯种；②遗传稳定；③易⽣长发育繁殖；④抗杂菌能⼒强；⑤对诱变剂敏感；⑥⽣产产物品质好、产量⾼、产出快。

02 第四章⼯业微⽣物育种诱变剂
1.紫外线诱变育种的作⽤机制及步骤。

紫外线的光谱范围为40~390nm，其中有效的诱变波长为200~300nm，DNA 吸收峰值在254nm处，此时诱变效果最好。

UV 诱变的主要原因是单链相邻碱基或双链间形成嘧啶⼆聚体。

单链TT⼆聚体易造成复制在该处停⽌或碱基错误插⼊该缺⼝形成突变；双链间TT⼆聚体交联，减弱双键间氢键的作⽤，并引起双链结构扭曲变形，阻碍双链分开，使复制⽆法进⾏。

最终引起碱基置换、缺失或移码。

A和T的⽐例越⾼，对紫外线就越敏感。

步骤：①出发菌株；②前培养（加酵母膏等，⽬的是培养细菌到对数期；霉菌、放线菌孢⼦刚萌发）；③制备菌菌悬液；④紫外线照射；⑤后培养（加⾊氨酸、异烟肼等，⽬的是抑制修复、减少死亡、促进正突变体增殖）；⑥稀释涂⽫。

紫外辐射剂量：绝对剂量单位erg/mm2，要剂量仪测定，较⿇烦；相对剂量单位⽤照射时间或杀菌率表⽰，⼀般认为以杀菌率90%~99.9%较好。

15W紫外灯波长集中在253.7nm，诱变效果⽐30W的好。

2.突变后其基因型是否会很快表现？为什么？
表型延迟2代以上，原因有：1、与诱变剂性质和细胞壁结构组成有关；2、当突变发⽣在多核细胞中的某⼀个核，该细胞就成为杂核细胞了；3、原有基因产物的影响。

（产⽣原因：①分离性迟延现象②⽣理性迟延现象）
3.物理诱变剂主要有哪⼏类？请举例？
紫外线，X射线，γ射线，快中⼦，α射线，β射线，微波，超声波，电磁波，激光射线和宇宙射线等。

4.化学诱变剂主要有⼏⼤类？
碱基类似物；脱氨剂；烷化剂；羟化剂；⾦属盐类；吖啶类；秋⽔仙碱等。

5、使⽤化学诱变剂时需要注意什么？
1.诱变剂量：主要取决于化学诱变剂浓度和处理时间，化学诱变使⽤剂量要以诱变效应⼤，⽽副反应⼩为原则。

处理时的温度对诱变效应也有⼀定影响。

2.注意安全、防⽌污染：绝⼤多数化学诱变剂都有毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使⽤时要格外⼩⼼，不能直接⽤⼝吸，避免与⽪肤直接接触，不仅要注意⾃⾝安全，也要防⽌污染环境造成公害。

03 第五章菌种的分离筛选
1、⼯业微⽣物的来源？
①向菌种保藏机构索取（如ATCC、CCCCM、IFO）有关菌株，从中筛选所需菌株；②由⾃然界采集样品，如⼟壤、⽔、动植物体等，从中进⾏分离筛选；③从发酵制品中分离⽬的菌株。

要经过采样、富集、分离、产物鉴定等步骤。

2、从⼟壤中筛选微⽣物时，采样应该注意⼀些什么问题？
根据⼟壤特点：1、⼟壤有机质含量和通⽓情况；2、⼟壤酸碱度和植被状况；3、地理条件；4、季节⽓候；
采样⽅法：⽤取样铲，将表层5cm左右的浮⼟除去，取5-25cm处的⼟样10-25g，装⼊事先准备好的塑料袋内扎好。

3、富集培养的定义与意义。

在⽬的微⽣物含量较少时，根据微⽣物的⽣理特点，设计⼀种选择性培养基，创造有利的⽣长条件，使⽬的微⽣物在最适环境下迅速地⽣长繁殖、增加数量，由原来⾃然环境下的劣势种变成⼈⼯条件下的优势种，以利分离到所需要的菌株。

4、纯种分离的⽅法有哪些？简述菌种分离和筛选的步骤。

纯种分离通常采⽤梯度稀释涂布法和划线法。

划线法是⽤接种针挑取微⽣物样品在培养基上直接划线（⼀般采⽤梯度划线法），培养后获得单菌落。

划线法简便、快速，但
所得到的单菌落不⼀定是纯种（可采⽤多次转接划线加以弥补）。

稀释法是先将样品经⽆菌⽔或灭菌⽣理盐⽔梯度稀释后，再涂布到固体培养基上，培养后获得单菌落。

稀释法使微⽣物样品分散更加均匀，获得纯种的概率更⼤。

⼀般每⽫cfu：细菌50个、霉菌10个为好。

5.通过控制营养和培养条件进⾏纯种分离：⼀般都采⽤筛选性平板辅以筛选性培养条件
（1）控制分离培养基中的营养成分（如C、N源）；
（2）控制培养基的pH值（霉菌、酵母偏酸；细菌、放线菌偏碱。

采⽤缓冲体系、碳酸钙、流加酸碱法）；
（3）控制培养温度（嗜热性菌、芽孢耐⾼温类；⼤类特性如细菌35度，霉菌27度）；
（4）加⼊抗⽣素等抑菌因⼦；
（5）控制供氧（分离厌氧、好氧菌）；
（6）控制培养基渗透压及空⽓压⼒。

6.利⽤⽣化反应进⾏分离（初步分离）：根据⽬的微⽣物的特殊⽣理特性或其代谢产物的⽣化反应进⾏设计。

透明圈法（培养基浑浊）；变⾊圈法（指⽰显⾊剂）；⽣长圈法（营养缺陷菌作指⽰）；抑菌圈法（抗⽣素敏感菌作指⽰）。

04 第六章微⽣物诱变育种
1、诱变育种⼯作中如何制备菌悬液？
在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞的均匀悬液状态。

原因：①分散状态的单细胞可均匀地接触诱变剂；②可避免长出不纯菌落。

菌悬液由出发菌株的孢⼦或菌体细胞⽤⽣理盐⽔或缓冲液制备，供试菌株的孢⼦或菌体要年轻、健壮。

菌悬液制备⽅法：细菌经20h-24h培养的新鲜斜⾯，移接到盛有基本培养基的三⾓瓶中，于35-37℃振荡培养到对数期，在于6℃培养1h使之同步⽣长，然后加⼊⼀定密度的嘧啶、嘌呤或酵母膏，继续振荡培养20-60min。

置于低温
10min，离⼼洗涤，⽤冷⽣理盐⽔或缓冲液制备菌悬液，放在盛有玻璃珠的三⾓瓶内振荡10min,令其分散，⽤⽆菌脱脂棉或滤纸过滤。

通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。

2、根据突变的光复活修复作⽤、原理，你认为在进⾏紫外线诱变处理时，应注意什么?为了使被诱变的细胞能均匀地受到紫外线照射，你将如何做？
注意：①必须在暗室或红光下进⾏，并且不能马上进⾏光照射；②照射距离要合适，不能太远，否则达不到诱变作⽤，也不能太近，否则菌体会死；③照射时间要恰当；④紫外灯的功能要适宜。

在紫外线照射时，盛菌液的培养⽫应置于磁⼒搅拌器上，边照射边搅拌使细胞能均匀受到紫外线照射。

3.紫外线引起的胸腺嘧啶⼆聚体对微⽣物有何影响？哪些修复系统可对此进⾏修复。

紫外线的光谱范围为40~390nm，其中有效的诱变波长为200~300nm，DNA 吸收峰值在254nm处，此时诱变效果最好。

UV 诱变的主要原因是单链相邻碱基或双链间形成嘧啶⼆聚体。

单链TT⼆聚体易造成复制在该处停⽌或碱基错误插⼊该缺⼝形成突变；双链间TT⼆聚体交联，减弱双键间氢键的作⽤，并引起双链结构扭曲变形，阻碍双链分开，使复制⽆法进⾏。

最终引起碱基置换、缺失或移码。

A和T的⽐例越⾼，对紫外线就越敏感。

有光修复、切补修复、重组修复、SOS修复系统。

还有聚合酶的校正作⽤。

4.某⼈将⼀细菌培养物⽤紫外线照射后，⽴即涂布在加有链霉素（Str）的平板上，放在有光条件下培养，从中筛选Str 抗性突变株，结果没有长出Str抗性菌落，试分析失败的原因？
1、紫外线诱变后见光培养，造成光修复，使得突变率⼤⼤下降，以致选不出str抗性菌株；
2、紫外线的照射后可能根本没有产⽣抗str的突变或突变株已死亡。

05 第⼋章营养缺陷型菌株的筛选
1.基本、完全、补充培养基的概念
⑴基本培养基（MM）：仅能满⾜野⽣型菌株⽣长要求的培养基，称为基本培养基；常以‘[-]’表⽰。

⑵完全培养基（CM）：凡可满⾜⼀切营养缺陷型菌株营养要求的培养基；⼀般在基本培养基中加⼊⼀些富含氨基酸、维⽣素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋⽩胨、酵母膏等，常⽤‘[+]’表⽰。

⑶补充培养基（SM）：只可满⾜相应营养缺陷型⽣长需要的培养基；在基本培养基中针对性地加⼊该菌株不能合成的营养因⼦，补充培养基可按所加⼊营养成分相应地⽤‘[A]’、‘[B]’等来表⽰。

2.野⽣型、营养缺陷型、原养型的概念
野⽣型(wild type)：从⾃然界分离到的微⽣物在其发⽣突变前的原始菌株，称为野⽣型菌株。

营养缺陷型（auxotroph）：野⽣型菌株经⼈⼯诱变或⾃然突变失去合成某种营养的能⼒，只有在MM中补充所缺乏的营养因⼦才能正常⽣长，这样的变异菌株称为营养缺陷型。

如：lys—；his—。

常常⽤作微⽣物育种的筛选标志、代谢调控育种的⾼产突变株等。

原养型(prototroph)：指营养缺陷型经回复突变或重组变异后产⽣的菌株，其营养要求在表型上与野⽣型相同。

3.营养缺陷型菌株的筛选要经过：诱发突变、淘汰野⽣型、检出缺陷型、鉴定缺陷种类。

4.淘汰野⽣型的⽬的、原理及⽅法如何？
⽬的：使缺陷型菌株得以富集，以利于检出；
原理：限制营养成分使缺陷型细胞⽣长受抑制，野⽣型细胞在⽣长过程中被杀死或⽣长后被除去。

⽅法有1）抗⽣素法：
野⽣型能在MM中⽣长，⽽缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野⽣型⽣长，处于活化阶段，⽽缺陷型⽆法⽣长，仍处于休眠状态。

由于细菌或酵母对⼀些抗⽣素敏感，于是就相应加⼊⼀定量的抗⽣素，结果活化状态的野⽣型就被杀死，缺陷型因不能⽣长⽽保存了。

⼀般细菌可以采⽤青霉素，酵母可采⽤制霉菌素。

2）菌丝过滤法：
适⽤于丝状菌（放线菌、霉菌）。

原理：野⽣型孢⼦可在MM上发育成菌丝，不能通过滤膜；不可在MM上⽣长的营养缺陷型孢⼦可通过滤膜，通过过滤可分离两者。

3）⾼温杀菌法：
适⽤于产芽孢、孢⼦菌。

基本培养基上只有野⽣型芽孢⽣长发育成营养体，营养缺陷型芽孢不⽣长；加热杀死对热
敏感的野⽣型营养体，⽽保留了耐热的营养缺陷型芽孢。

细菌——80℃酵母——60 ℃。

5.如何检出营养缺陷型突变株？
原理：在固体基本培养基和完全培养基上，⽣长情况完全不同，缺陷型在CM上⽣长良好，⽽在MM上则不⽣长，野⽣型都能⽣长。

检出具体⽅法：①影印法1．将⼀较平⽫直径⼩1cm的⾦属圆筒蒙上⼀层灭菌的丝绒，⽤⾦属夹夹住，灭菌。

2．将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻⼀压，使之成为印模，标记⽅位。

3．将基本培养基平⽫和完全培养基平⽫在标记的同⼀⽅位上先后轻轻⼀压，此菌印模即复印于上。

4 ．将CM和MM在恒温箱中培养。

5．⼆平⽫相同⽅位进⾏⽐较，即可发现在MM平⽫上长出的菌落少于GM平板上的。

MM上未长⽽相应于CM上长出的那⼏个菌落就可能是缺陷型。

此法要求平⽫上菌落不能太多，菌落之间应有⼀定间隔。

②点植对照法：⽤接种针或⽛签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后⼀起培养，观察其⽣长情况。

此法结果明确，但⼯作量⼤。

③夹层法：先在培养⽫上倒⼀层基本琼脂培养基，凝固后涂上⼀层含菌的MM，凝固后再倒⼀薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上⼀层CM琼脂培养基，再培养。

这时第⼆批长出的菌落就可能是缺陷型。

此法缺点是，结果有时不明确，⽽且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。

④限量补充培养法。

6.鉴定营养缺陷型步骤：可分为两类：⼀种⽅法是在⼀个平⽫中加⼊⼀种营养物质以测定多株缺陷型菌株对该⽣长因⼦的需求情况；第⼆种⽅法是在同⼀平⽫上测定⼀种缺陷型菌株对许多种⽣长因⼦的需求情况，成为⽣长谱法。

步骤：测定缺陷型菌株所需⽣长因⼦的类别→具0体测缺陷该类别物质中的哪种⽣长因⼦→⽤单⼀⽣长因⼦进⾏复证试验。

7.⽤什么⽅法可获得⼤肠杆菌（E. coli）的组氨酸缺陷型？
本次是为了获得His—E. Coli，可经过：
1.诱变：物理（常⽤紫外线）、化学诱变。

2.采⽤抗⽣素法（加⼊青霉素）淘汰⾮His—E. Coli：将诱变后的菌体⽤CM振荡培养3代结束表型延迟，离⼼、洗涤后在MM 饥饿培养5⼩时，涂在不加His的MM上培养，使野⽣型菌进⼊对数期⽽His—菌株不⽣长，加⼊青霉素杀死活化⽽敏感的⾮His —菌株。

3.检出His—E. Coli：将经过上述步骤的培养物稀释、涂⽫、富集培养后，再⽤点植对照法或影印法找出在加有His的CM上⽣长、但在不加His的MM上不⽣长的菌株。

4.鉴定His—型：将检出的His—菌株再次分别涂在加有His的CM和不加His的MM上培养，若在不加His的MM上不⽣长，则说明该菌株是纯His—型；否则就要重新检出His—型再鉴定。

8.⽤野⽣型的⼤肠杆菌为出发菌株，可⽤哪种诱变剂怎样进⾏诱变得到Leu—突变株，如何检出和鉴定该突变株？
（1）、有物理、化学、⽣物的诱变剂，常⽤紫外线诱变（简单、⽅便、实⽤），操作：
①出发菌株：野⽣型E. Coli纯培养；
②前培养：加酵母膏、核酸⽔解物等，⽬的是培养细菌到对数期；霉菌、放线菌孢⼦刚萌发。

③制备菌菌悬液：放⼊盛有玻璃珠的三⾓瓶内振荡10min,令其分散，滤纸过滤；调整菌液浓度为108个/ml。

④紫外线照射：菌液放在距离紫外灯30cm处，通过控制照射时间来控制照射剂量，如以10秒为间隔的0S~60S或以10min为间隔的0min~60min；照射前，紫外灯预热20min；照射过程，⽤磁⼒搅拌⼦边搅拌边照射；照射完毕后，在暗室的红光下操作。

⑤后培养（加⾊氨酸、异烟肼等，⽬的是抑制修复、减少死亡、促进正突变体增
殖）。

⑥稀释涂⽫。

（2）、检出和鉴定该突变株Leu—突变株
1.采⽤抗⽣素法（加⼊青霉素）淘汰⾮Leu—E. Coli：将诱变后的菌体⽤CM振荡。