人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的研制及其β亚基羧基末端37肽（βhCG-CTP..

人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的研制及其β亚基羧基末端37肽(βhCG-CTP)真核表达的研究
摘要
人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，是最早出现的妊娠特异性物质，hCG的合成与分泌与妊娠密切相关。

在妊娠早期hCG的浓度迅速升高，检测尿中的hCG即可证实妊娠，因此，抗hCG单克隆抗体的研制对于早早孕检测具有重要意义。

但用完整的抗hCG分子抗体检测hCG时与LH间有免疫交叉反应。

而hCG的β亚基羧基端109~145残基组成的37肽(human chorionic gonadotrophin-β carboxyl terminal peptides，βhCG-CTP)是hCG分子所特有的片段，并存在hCG的特异表位(抗原决定簇)，其抗体具有更好的hCG抗原特异性，不会与促黄体生成激素(luteinizint hormone,LH)发生交叉反应。

采用抗βhCG羧基末端37肽单克隆抗体可以进一步提高检测的敏感性和特异性并为避孕疫苗的研制奠定基础。

因此，本研究在成功地制备了hCG单克隆抗体之后，进一步真核克隆表达了βhCG-CTP，为下一步基因免疫法制备单克隆抗体作了一定的准备，也为hCG基因避孕疫苗的研制奠定了基础。

第一部分人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的研制
目的获得针对人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体。

方法 hCG蛋白免疫Balb/c小鼠，取其脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞NS-1按8:1比例融合，用间接ELISA法筛选阳性克隆，再用有限稀释法进行扩大及克隆化培养；经对杂交瘤细胞株进行核型分析和克隆化培养，得到能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以此杂交瘤细胞接种小鼠腹腔，制备腹水抗体；收集抗体，采用间接ELISA法鉴定抗体亚型、测定抗体效价和抗体特异性及交叉反应性比较。

结果 1. 共免疫8只小鼠，血清抗体效价均达10-6以上，说明免疫效果较好，可进行细胞融合；2. 得到6株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，间接ELISA法测定其OD值均在1.0以上，说明分泌抗体的能力较强，在克隆化培养过程中，其OD值均呈稳定升高趋势，说明细胞株分泌抗体的稳定性良好；
3. 制备的腹水抗体经鉴定均为IgG1、κ型，效价均达10-5以上；
4. 以hCG、LH、α-LH、β-LH分别包被酶标板检测经两次克隆化的A1a1、A2a1、A3a1、A4a1、A5a1、A6a1 6株细胞株培养上清与它们的交叉反应性，结果显示：6株杂交瘤细胞株培养上清与hCG
反应的OD值都在1.0以上，说明6株杂交瘤细胞株分泌抗hCG单克隆抗体的能力较强。

杂交瘤细胞株A2a1、A4a1和A6a1与完整LH分子反应的OD值>0.3，有弱交叉反应；杂交瘤细胞株A2a1、A5a1和A6a1与α-LH反应的OD值>0.1，有弱交叉反应；杂交瘤细胞株A1a1、A2a1、A4a1与β-LH反应的OD值>0.1，有弱交叉反应。

结论所获得的6株杂交瘤细胞株均有较强稳定分泌抗hCG单克隆抗体的能力。

其中3株与完整LH分子有弱交叉反应，3株与α-LH分子有弱交叉反应，3株与β-LH有弱交叉反应。

这为有关hCG的检测、hCG本身相关研究以及避孕疫苗的研制打下了基础。

第二部分βhCG-CTP/pcDNA3重组真核表达载体的构建及表达
目的克隆并表达βhCG-CTP基因片端，探讨采用βhCG-CTP基因片段免疫小鼠进行免疫避孕的可能性。

方法采用化学合成法得到含有βhCG-CTP基因片段的pUC18质粒；以合成的含有βhCG-CTP DNA片段的pUC18质粒为模板，PCR扩增βhCG-CTP DNA片段，将βhCG-CTP DNA片段与pcDNA3经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后，再用T4DNA连接酶连接，然后将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养；利用脂质体介导将pcDNA3/βhCG-CTP重组质粒表达载体转染到COS-7细胞，免疫组化法检测βhCG-CTP基因在哺乳动物细胞中的表达情况。

结果1. PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳图谱上出现一条与分子量吻合的主条带，该片段位于100bp与200bp DNA marker之间。

根据PCR所用引物、模板和所得产物在琼脂糖凝胶电泳图谱的位置推断所得产物为βhCG-CTP DNA片段；2. 连接产物转化培养结果显示：感受态细菌状态良好，pcDNA3与目的基因βhCG-CTP连接效果很好，自连比率极低，初步判定重组质粒转化成功；3. 重组质粒经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切和测序证实插入序列与预期设计完全一致；4. 利用脂质体介导将pcDNA3/βhCG-CTP 重组质粒表达载体导入COS-7细胞，48hr后，免疫组化检测发现，经pcDNA3/ βhCG-CTP重组质粒转染的COS-7细胞胞质中可见明显的棕色物质，表明pcDNA3/ βhCG-CTP片段在COS-7细胞中得到了有效表达。

结论成功构建了βhCG-CTP 真核表达载体pcDNA3/βhCG-CTP，该载体能在哺乳动物细胞中正确表达，表达产物βhCG-CTP能够被抗βhCG抗体所识别。

为下一步基因免疫法制备单克隆抗体作了一定的准备，也为hCG基因避孕疫苗的研制奠定了基础。

关键词：人绒毛膜促性腺激素，单克隆抗体，人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端37肽，pcDNA3/βhCG-CTP重组质粒。

Generation and identification of monoclonal antibody against human chorionic gonadotrophin and eukaryotic expression of hCG-β carboxyl terminal peptides (βhCG-CTP)
Abstract
Human chorionic gonadotrophin is a kind of glycoprotein hormone secreted by placent syncytiotrophoblastic cell. It’s a kind of cyesis specific substance which appears early trimester of pregnancy. Synthesis and secretion of hCG correlate with gestation closely. In early stage of gestation, the concentration of serum hCG rises quickly. Early pregnancy can be confirmed by measuring hCG in the urine. Therefore, it is of great significance to generate the monoclonal antibody against hCG for the examination of early pregnancy. However, monoclonal antibody against hCG also cross-react to luteinizint hormone, thus detection of hCG using its MAb is not a specific method for diagnosing pregnancy. Nevertheless, a 37-amino acid peptide from the C-terminal end of β-hCG is unique to hCG, comprises specific epitope and has been targeted as a potent immunogen. The use of C-terminal peptide (CTP) provides an hCG-specific response against its MAb, which lacks cross-reactivity with hLH. The generation of monoclonal antibodies which binds to the CTP37 on the native hCG heterodimer, in the absence of hLH cross-reactivity will definitely contribute a lot to the betterment of the specificity and sensitivity of the examination of hCG. Therefore, after preparation of MAb of hCG, we further cloned and expressed βhCG-CTP in mammalian cell line, which was the groundwork for the generation of MAb against βhCG-CTP by gene immunization and the development of genetic contraceptive vaccines based on hCG.
Part I. Generation and identification of monoclonal antibody against human chorionic gonadotrophin
Objective To obtain monoclonal antibody against hCG. Methods Balb/c mice were immunized with hCG protein, and spleen cells from the mice were fused with myeloma cells from isogenic mice at 8:1 ratio. Positive clones were screened by indirect enzyme-linked immunoadsordent assay. The clones were then subcloned with limiting
dilution and amplified further. After karyotype analysis and cloning culturing of hybridoma cell strains, the cell strains that secreted MAb stably were obtained. Followed injection i.p. of hybridoma cells, mouse ascites antibody were prepared. Ascites antibody was harvested, then antibody isoforms, titres, specificity and cross-reactivity were identified and determined respectively with indirect enzyme-linked immunoadsordent assay. Results1. After eight mice were inoculated, the serum antibody titer reached 10-6 above, which indicated that the effect of immunization was well and cell fusion could be done at this time. 2. Six strains of hybridoma cell lines secreting MAb stably were obtained and indirect enzyme-linked immunoadsorbent assay showed that the optical density (O.D.) values of all strains were 1.0 upwards which indicated the strong competence for these strains to secrete MAb. During the cloning culturing, O.D. value of all strains have the tendency of stable increase which suggested the good stability of secreting MAb of hybridoma cell strains. 3. Prepared ascites MAb from all mice were identified as IgG1 and κ type, and the titre all reached 10-6 above. 4. hCG, LH, α-LH and β-LH were coated to 96-well plate and the reactivity between these antigen and culture supernatant from twice cloned cell strain A1a1, A2a1, A3a1, A4a1, A5a1 and A6a1 were detected. Results showed that the O.D. values after reaction between culture supernatant from the six cell strains and hCG all were 1.0 above, which indicated these strains could secret antibody well. Feeble cross-reactivity between the culture supernatant from strains A2a1, A4a1 or A6a1 and the integrate LH molecules were observed. Mild cross-reactivity between the supernatant from strain A2a1, A5a1 or A6a1 and α-LH protein also could be observed. Analogous results came forth between strainA1a1, A2a1 or A4a1 and β-LH protein. Conclusion The obtained 6 strains of hybridoma cell lines can secret MAb stably. Three among the 6 strains have mild cross-reactivity to integrate LH, α-LH and β-LH. This research provides a fundamental basis for developing new specific detection method of hCG, the correlative study of hCG itself and the preparation of contraceptive vaccines.
Part II: Construction and eukaryotic expression of Recombinant plasmid βhCG-CTP/pcDNA3
Objective To clone and express βhCG-CTP gene fragment and to explore the possibility of mouse immunocontraception with βhCG-CTP gene fragment. MethodsβhCG-CTP gene fragment was chemically synthesized and inserted into pUC18 plasmid. pUC18 plasmids carrying βhCG-CTP gene fragment were used as templates for polymerase chain reaction (PCR) of βhCG-CTP DNA fragment. 5’-end of each primer used for PCR
contained EcoR I and BamH I restriction sites respectively. The PCR product of βhCG-CTP DNA fragment was digested with EcoR I and BamH I together, and then ligated to eukaryotic expression vector pcDNA3 which was also digested under the same condition. Product of ligation reaction was transformed into Escherichia coli DH5α and cultured overnight on the plates containing ampicillin. The potential recombinant plasmids from positive clones were identified with restriction enzyme and sequencing methods. After recombinant plasmid pcDNA3/βhCG-CTP were transfected into COS-3 cells with liposome, the expression of βhCG-CTP gene fragment in mammalian animal cells was detected with immunohistochemistry method. Results1. PCR product migrated as one major band on 2% agarose gel. The major band located between 100bp and 200bp DNA marker bands and the apparent molecular weight of the major band was identity to that of experctation, which suggested that this band represent βhCG-CTP DNA fragment. 2. After product of ligation reaction was transformed into E.Coli DH5α, large amount of positive clones presented on the experimental plates while no clone presented on negative control plate, which indicated the efficiency of ligation reaction between pcDNA3 and βhCG-CTP gene was high and auto-ligation ratio was very low, and also indicated initially the recombination was successful. 3. Double restriction enzymes digestion and subsequent sequencing of recombinant plasmids confirmed the correction of the recombinant plasmids. 4. Recombinant plasmids pcDNA3/βhCG-CTP were transfected into COS-7 cells with liposome. 48 hours later, obvious brown particles were observed in the cytoplast of COS-7 cells transfected with pcDNA3/βhCG-CTP recombinant plasmids, which indicated pcDNA3/βhCG-CTP gene expressed effectively in COS-7 cells. Results Recombinant plasmids pcDNA3/βhCG-CTP which can express βhCG-CTP gene in mammalian animal cells have been constructed correctely. The expressed product βhCG-CTP can be recognized by antibody against βhCG. This work ground for the next work of the preparation of monoclonal antibody by genetic immunization and for the development of hCG gene contraceptive vaccines.
Key Words: human chorionic gonadotrophin(hCG)；monoclonal antibody(MAb)；human chorionic gonadotrophin-β carboxyl terminal peptides(βhCG-CTP) ；pcDNA3/βhCG-CTP recombinant plasmid；
英文缩写词一览表
英文缩写英文全称中文对照
A
8-AG aminopterin
azaguanine
氨基蝶呤
8-氮鸟嘌呤
Amp ampicillin 氨苄青霉素
bp base pair碱基对
BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白
cAMP cyclic adenosine monophosphate环磷酸腺苷
cGMP cyclic guanosine monophosphate环磷酸鸟苷
CpG c ytosine-phosphate-guanine非甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤DAB diaminobenzidine二氨基联苯胺
d2H2O DMEM double distilled H2O
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
双蒸水
DMEM培养基
DMSO dimethylsulfoxide二甲基亚砜
DNA deoxyribonucleotide acid脱氧核糖核苷酸E estrin 雌激素
EB ethidium bromide溴乙锭
EDTA ethylenediaminetetra-aceticacid
(medium)
EDTA培养基
EGF epidermal growth factor 表皮生长因子ELISA enzyme-linked immunoadsordent assay酶联免疫吸附测定FCA Freund's complete adjuvant弗氏完全佐剂
FIA Freund's incomplete adjuvant弗氏不完全佐剂FCS fetal calf serum胎牛血清
FSH ollicle stimulating hormone卵泡刺激素
H hypoxanthine次黄嘌呤
hr hour小时
HAT hypoxanthine aminopterin thymidine (medium) 次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶培养基
HT hypoxanthine thymidine (medium)次黄嘌呤胸腺嘧啶培养基hCG human Chorionic Gonadotrophin人绒毛膜促性腺激素
á-hCG human Chorionic Gonadotrophin á
subunit
人绒毛膜促性腺激素á亚基
âhCG human Chorionic Gonadotrophin â
subunit
人绒毛膜促性腺激素â亚基
âhCG-CTP human Chorionic Gonadotrophin â carboxyl terminal peptides 人绒毛膜促性腺激素â亚基羧基末端
HCLRF human Chorionic Gonadotrophin
releasing factor
人绒毛膜促性腺激素释放因子
HGPRT hypoxanthine-guanine-phospheeeribosyl-
Transferase
次黄嘌呤磷酸核糖转化酶hLH human luteinizing hormone人促黄体生成激素
HRP horseradish peroxidase辣根过氧化物酶
ISS immune stimulate sequence免疫刺激序列
Ig immunoglobulin免疫球蛋白
LB luria-bertani (medium)LB培养基
LH luteinizing hormone 促黄体生成素
LHRH luteinizing hormone-releasing hormone 促黄体(生成)激素释放激素MAb monoclonal antibody 单克隆抗体
min minute 分钟
mRNA messengerribonucleicacid 信使核糖核酸
OPD ortho phenylene diamine 邻苯二胺
P progestin 孕激素
PBS phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲液
PCR polymerase chain reaction 聚合酶链反应
PG prostaglandin 前列腺素
PEG polyethylene glycol 聚乙二醇
RT-PCR reverse transcription-polymerase chain
reaction
反转录－ PCR
rpm revolutions per minute 转/分
s second 秒
SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylami-de
gel electrophoresis
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SOB s ulfide-oxidizing bacteria (medium) SOB培养基
T thymidine 胸腺嘧啶
Taq Taq DNA polymerase 耐热性DNA聚合酶TK thymidine kinase 胸腺嘧啶核苷激酶　TRH thyroi releasing hormone 甲状腺释放激素　TSH thyroid stimulating hormone 促甲状腺激素　
人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的研制及其β亚基羧基末端37肽(βhCG-CTP)真核表达的研究
前言
抗体是构成机体免疫力的一类重要物质，也是医学及兽医学中用于疾病诊断、治疗、预防和研究发病机理的极为重要的常用试剂或制剂。

单克隆抗体(monoclonal antibody，MAb)因其结构相同、成分均一，特异性强、生物活性高等特性，对抗原的生物学特性、抗原性研究，以及对抗原性疾病的诊断、治疗、免疫机制的研究等均具有重要意义。

单克隆抗体试剂已成为生物医学研究中用作检测及治疗的重要工具[2]。

人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，其相对分子质量约为38,000Da，碳水化合物约占其分子量的30%。

hCG分子含有两个亚基(亚单位)，分别被称为α亚基和β亚基，两个亚基的分子结构不相同，由非共价键将两个亚基连结在一起形成二聚体结构[3]。

其单个亚基不具有生物活性，当连接成完整化合物时始具活性。

hCG的生物学活性和免疫学特性由β亚基决定[4]。

hCG是最早出现的妊娠特异性物质，hCG的合成与分泌与妊娠密切相关[5]。

它从胎盘滋养层通过血循环进入卵巢，刺激黄体分泌孕酮维持黄体功能，使子宫内膜保持适合胚胎着床发育的状态[6]。

在妊娠早期hCG的浓度迅速升高，检测尿中的hCG即可证实妊娠，因此，抗hCG的单克隆抗体的研制对于早早孕检测具有重要意义[7]。

但由于hCGα亚基氨基酸排列与促黄体生成素(LH)α亚基相似，hCGβ亚基与卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺素(TSH)在结构方面有某些相似之处；hCGβ亚基含有2个多分支糖基和3个线状单寡糖基，其氨基酸顺序有80%与人促黄体生成激素(hLH)的β亚基相同，所以它们的生理作用也类似[8]。

故用完整的抗hCG分子抗体检测hCG时与LH间有免疫交叉反应，抗α-hCG的抗体无法识别α-hCG和甾体糖蛋白之间的差异[12]，由于含有部分相似的氨基酸链，到目前为止尚没有找到可完全使βhCG 的抗血清不与hLH交叉的方法[6]。

而hCG的β亚基羧基端109~145残基组成的37肽(human chorionic gonadotrophin-β carboxyl terminal peptides，βhCG-CTP)是hCG分子所特有的片段，并存在hCG的特异表位(抗原决定簇)，其抗体具有更好的抗原特异性，不会与促黄体生成激素(LH)发生交叉反应[9~11，13]。

因此采用抗βhCG羧基末端37肽单克隆抗体可以进一步提高检测的敏感性和特异性[14]。

有许多研究表明，在滋养层细胞肿瘤和非滋养层细胞肿瘤病人的血和尿中有游离的hCG的β亚基存在[15]。

74种不同种类和起源的已建株的人肿瘤细胞系经流式细胞
计数被证明发现有hCG或其片段[16]，在人类28种肿瘤细胞系中RT-PCR结果说明β-hCG mRNA是可以翻译的[6]。

各种肿瘤细胞系hCG特异mRNA表达近来也有报道[15，17]。

因此，在血清中hCGβ的检测，尤其在男性，被看成是和肿瘤相关的标志，它也为有活性的免疫治疗提供了一种候选目标蛋白[15，18]。

由于hCG在妊娠早期对维持黄体分泌孕酮有重要作用，是维持正常妊娠所必需的，因此，hCG被认为是发展避孕疫苗的理想靶抗原[19]。

基因疫苗是当前研究的热点[20，21]。

所谓基因疫苗，就是把外源基因克隆到真核表达质粒载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应[22]。

从1990年Wolff等首次提出基因疫苗的设想到1993年Ulmer等在小鼠中开始试验，至今已有十多年，在这短短的十余年中，该领域的发展出人意料地迅速，被称为继减毒活疫苗/灭活疫苗和亚单位疫苗之后的第三次疫苗革命[23~25]。

基因疫苗具有制备简单、成本低廉、使用方便、效果好、安全性高等许多优点，是一种极具发展潜力的疫苗[26]。

1996年，美国颁布了有关基因免疫技术的操作守则和使用意见，同年批准在健康人身上进行预防艾滋病的基因疫苗临床试验。

现在已有近10种分别针对艾滋病、癌症、疟疾等疾病的基因疫苗进入临床试验阶段[27，28]，针对狂犬病、生殖器疱疹、麻疹和过敏等各种疾病的基因疫苗研制也在进行中，一旦通过临床试验，基因疫苗将进入商品化生产，成为常规的预防和治疗手段。

基因疫苗作为一种新型的免疫方法，其特点是：基因免疫后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达，其加工处理过程与病原的自然感染过程相似，因此，可表达出与病原体相似的抗原。

同时，两者的抗原提呈过程亦相似，可以与自然感染一样，诱导动物既产生细胞免疫，也产生体液免疫[29，30]。

为了探讨使用基因疫苗这种新型的免疫方法来进行免疫避孕的可能性，我们选用编码hCGβ亚基羧基端109~145残基组成的37肽(βhCG-CTP)cDNA序列，并克隆到真核表达载体pcDNA3，构建重组质粒pcDNA3/βhCG-CTP，证明在真核系统可以表达。

这为基于hCG避孕疫苗的研制提供了线索；同时，也为利用基因疫苗方法制备单克隆抗体奠定了实验基础。

第一部分　人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的制备及鉴定　
材料与仪器
一
Balb /c小鼠
小鼠骨髓瘤细胞株NS-1
各种培养瓶24孔培养皿
常规实验器材1ml和10ml吸管1ml和10ml注射器盐水瓶及橡皮塞各种规格的离心管
二
Forma公司
Forma公司
乐山市东亚机电工贸有限公司
SANYO公司
Millipore公司
Gelman公司
型倒置显微镜
Microplate Reader-Model 550型酶标仪　
Ａｖａｎｔｉ　Ｊ－２５型高速冷冻离心机　
ＤＵ－６４０型紫外分光光度仪　
７２０Ａ　型pH计
HV-110型自动高压灭菌装置
系列单Eppendof公司
Sartorius公司
常州电器国华有限公司
５０－ＢＳ型隔水式恒温电热培养箱
BCD-268型海尔家用电冰箱　
ＥＲ－Ｃ２００型刨冰机
WP750微波炉
小动物实验器材镊子眼科镊子医用黏合剂
第一部分人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的制备及鉴定
材料与仪器
一、材料
实验动物：Balb /c小鼠，购自北京动物实验中心；
小鼠骨髓瘤细胞株NS-1，由云南大学单克隆抗体工程技术中心提供；
各种培养瓶，6孔、24孔、96孔培养板，培养皿，B.D.公司 FALCON产品；
常规实验器材：细胞计数板、1ml和10ml吸管、毛细吸管、1ml和10ml注射器、4号和7号针头、盐水瓶及橡皮塞、烧杯，各种规格的离心管，细胞冷冻管及冻存小盒子等；
二、主要仪器
3110型CO2培养箱：Forma公司；
HF safe-1200型超净工作台：Forma公司；
YDS-110B-290F型液氮罐：乐山市东亚机电工贸有限公司；
SANYO-MDF-U50VC型低温冰箱：SANYO公司；
Milli-Q超纯水系统：Millipore公司；
过滤设备：Gelman公司；
P-Ⅲ型倒置显微镜：Nikon公司；
Microplate Reader-Model 550型酶标仪：Bio-Rad公司；
Avanti J-25型高速冷冻离心机：Beckman；
DU-640型紫外分光光度仪：Beckman；
720A 型pH计：Orion公司；
HV-110型自动高压灭菌装置：HIRAYAMA公司；
系列单、多道微量加样器及配套尖头：Eppendof公司；
BP211D型电子天平：Sartorius公司；
HH-42型快速恒温数显水箱：常州电器国华有限公司；
PYX-DHS-40×50-BS型隔水式恒温电热培养箱：上海跃进医疗器械厂；
BCD-268型海尔家用电冰箱：青岛海尔电冰箱股份有限公司；
ER-C200型刨冰机：番禺嘉宏食品机械有限公司；
WP750微波炉：顺德市格兰仕电器实业有限公司；
小动物实验器材：剪子、镊子、眼科剪子、眼科镊子、止血钳、医用黏合剂、小鼠解剖台板。

三、主要试剂
hCG(10,000IU/mg)、hLH(10,000IU/mg)、α-LH(5,000IU/mg)、β-LH(5,000IU/mg)：Sigma公司；
弗氏完全佐剂(FCA)及弗氏不完全佐剂(FIA)、HAT、HT条件培养基成份：GIBCO BRL公司；
DMEM 高糖培养基、RPMI1640培养基、胰酶、小牛血清(FCS)：Hyclone公司；
聚乙二醇(PEG，MW1,500)：Fluka公司；
BCA试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG：Pierce公司；
山羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA以及κ、λ轻链型的HRP标记抗体：晶美生物技术有限公司；
邻苯二胺(OPD)、 DAB、8-氮鸟嘌呤(8-AG)：Sigma公司；
牛血清白蛋白(BSA)：Randox公司；
二甲亚砜(DMSO)，国产，分析纯
其它试剂为国产，分析纯。

附：常用试剂的配制：
(1) ELISA包被液的配制：0.2M Na2HPO4 4.05ml
0.2M NaH2PO40.95ml
d2 H2O 45ml
(2) ELISA洗涤液的配制(0.05%Tween-20-PBS)：
81ml
0.2M Na2HPO4
0.2M NaH2PO419ml
d2 H2O 900ml
Tween-20 0.5ml
NaCl 8g；
(3) ELISA封闭液的配制(1%BSA-PBS-T)：
BSA 1g
PBS-T溶液100ml
(4) ELISA底物液的配制：0.05M柠檬酸 4.86ml
0.2 M Na2HPO4 2.57ml
双蒸水 2.57ml
临用前加邻苯二胺(OPD) 4mg
30% H2O215µl
(5) PBS缓冲液(Phosphate Buffered Saline)： NaCl 10g，KCl 0.25g，Na2HPO4 1.44g，
K2HPO4 0.25g，溶于双蒸水，定容至1,000ml；
(6) 电泳上样缓冲液(Loading Buffer)：
2.5％溴酚蓝母液 500µl (终浓度约0.25％)
甘油 1.5ml(终浓度约30%)
加水至5ml，无须高压；
(7) 电泳缓冲液(10×TBE)：
Tris 53.9g
先溶解这两项，再加EDTA，定容至
Boric Acid 27.5g 500 ml，无需高压；
EDTA 4.1g
(8) 100×氨苄青霉素溶液(50mg/ml)：取氨苄青霉素100万单位溶于100ml无菌水中，小量分装，-20℃保存，用于细菌培养基的抗菌添加剂；
(9) LB液体培养基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：
胰蛋白胨 10g
酵母提取物5g
NaCl 10g
摇动容器直至溶液质溶解。

用5mol/LNaOH(约0.2ml)调至pH7.0。

用去离子水定容至1L。

在1.034×105Pa下灭菌30min；
(10) LB固体培养基：按上述配方配制液体培养基，高压灭菌前加入Agar 15g/L；
(11) SOB培养基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：
胰蛋白胨20g
酵母提取物 5g
NaCl 0.5g 摇动容器直至溶液质溶解。

加10ml 250mmol/L溶液(将1.86gKCl用100ml去离子水溶解即配成250mmol/L KCl溶液)。

用5mol/L NaOH(约0.2ml)调至pH7.0。

用去离子水定容至1L。

在1.034×105Pa下灭菌30min。

该溶液在使用前，加入5ml灭菌的2mol/L MgCl2。

(12) 胰酶：0.25g胰酶，0.038gEDTA溶于100ml纯水中，过滤除菌，4℃保存。

(13) 2%秋水仙素母液：1mg秋水仙碱溶于50ml生理盐水(0.85%NaCl)中，浓度为20µg/ml，分装后冷冻保存；
(14) 姬姆萨染液缓冲液：混合32ml 1/15M Na2HPO4液和8ml 1/15M KH2PO4液；
(15) Giemsa染液工作液：取40ml姬姆萨染液缓冲液，滴加Giemsa原液25滴，临用时配制；
(16) 苏木素染液：埃利克(Ehrlich)氏苏木素染液
苏木素2g、无水乙醇100ml、甘油100ml、蒸馏水100ml、冰醋酸100ml、硫酸铝钾15g。

将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水中，溶解后将甘油倾入混合，然后再将苏木素酒精混合，最后加入冰醋酸。

待溶液全部溶解后让其在日光下自然成熟，时间约需3个月。

如加入300mg碘酸钠，使其迅速氧化即可使用。

此液优点是贮存越久，染色力越强，染色效果较好且溶液较稳定，不易出现结晶。

缺点是成熟时间长，需事先配制。

方法
一、hCG单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立[36,37]
(一) 免疫动物
选纯系Balb/c系雌鼠(6~8周龄)进行hCG抗原免疫。

首次基础免疫用弗氏完全佐剂(FCA)包裹的hCG乳液，剂量100µg/只鼠，皮下多点注射(小鼠腋下、大腿内侧、脊柱等淋巴较为密集的区域)；20天后进行第二次基础免疫，剂量100µg/只鼠，改为弗氏不完全佐剂(FIA)包裹，腹腔注射；30天后、40天后分别进行第三次、第四次基础免疫，程序同第二次基础免疫；基础免疫结束后5天尾部取血，进行抗体效价测定，确认免疫效果；在融合前3天进行一次加强免疫，脾内直接注射hCG溶液，剂量200µg/只鼠。

(二) 细胞融合及建株
1. 饲养细胞的制备：
操作程序：
(1) Balb/c小鼠，脱颈处死，浸泡于75%酒精2~3min；
(2) 小鼠移入超净台内，以仰卧位固定在解剖板上，用剪刀剪开其腹部皮肤，用镊子纵向拉开皮肤，暴露腹部，并用酒精消毒其腹膜；
(3) 用止血钳轻轻拉起腹膜，剪刀剪开一个小口，吸管吸取2~3ml培养基注入腹腔，再用吸管吸取细胞悬液，如此反复2~3次，调整细胞浓度至2×105个/ml；
(4) 将此饲养细胞接种于96孔培养板，以2×104个/ 100µl/孔的数量铺板。

然后置于5% CO2，37℃培养箱中培养。

2. 脾脏细胞的制备：
将经过有效免疫的Balb/c小鼠眼眶取血，用于测定抗体效价。

然后将小鼠脱颈处死，75%的酒精浸泡2~3min以消毒，在无菌条件下剖腹取其脾脏。

于事先准备好的培养基液中洗涤三次，小心去除粘附在脾脏上的结缔组织(注意不要将脾脏撕破以免
(16) 苏木素染液
无水乙醇100ml蒸馏水100ml硫酸铝钾15gÔÙ½«ÁòËáÂÁ¼ØÈÜÓÚÕôÁóË®ÖÐ
È»ºóÔÙ½«ËÕľËؾƾ«»ìºÏ´ýÈÜҺȫ²¿ÈܽâºóÈÃÆäÔÚÈÕ¹âÏÂ×ÔÈ»³ÉÊìÈç¼ÓÈë300mg碘酸钠此液优点是贮存越久染色效果较好且溶液较稳定缺点是成熟时间长
方法
一
首次基础免疫用弗氏完全佐剂(FCA)包裹的hCG乳液皮下多点注射(小鼠腋下
脊柱等淋巴较为密集的区域)¼ÁÁ¿100µg/只鼠
腹腔注射40天后分别进行第三次程序同第二次基础免疫进行抗体效价测定
在融合前3天进行一次加强免疫剂量200µg/只鼠
操作程序
脱颈处死　
（２）　小鼠移入超净台内用剪刀剪开其腹部皮肤
暴露腹部
(3) 用止血钳轻轻拉起腹膜吸管吸取2~3ml培养基注入腹腔如此反复2~3次１０5个/ml
ÒÔ2È»ºóÖÃÓÚ5% CO2培养箱中培养
将经过有效免疫的Balb/c小鼠眼眶取血然后将小鼠脱颈处死在无菌条件下剖腹取其脾脏
小心去除粘附在脾脏上的结缔组织(注意不要将脾脏撕破以免
损失脾细胞)加培养基液10ml
ÖƱ¸Æ¢Ï¸°ûÐüÒº弃除大块杂质
3. 骨髓瘤细胞NS-1的制备
作细胞活率测定
离心后重悬计数
操作程序
1,000rpm离心10min ÇáÇáÇôòÀëÐĹÜʹϸ°ûÐü¸¡
±ßÓÃ1ml滴管逐滴加入经50
PEG所有操作需在60s内完成再静置30s
ÓÈÆä×¢ÒâÔÚ¼ÓÈ뿪ʼ10ml 时须沿离心管壁慢慢加入以免损伤融合细胞使PEG彻底混匀稀释
弃上清
轻轻混匀后逐孔滴加入预铺饲养细胞的96孔培养板中然后置于5% CO2培养箱培养
融合后的第二天以后每隔3~4天换液换为HT-DMEM-20% FCS培养基
期间镜检各孔克隆状况待克隆生长至适当密
度时(约10用ELISA检测培养上清中是否含有所需的特异抗体存在
(三) 间接ELISA检测阳性抗体分泌细胞株
1. 包被抗原
溶于磷酸盐缓冲液(0.02M每孔溶液体积为100µlÖÃÓÚ37ÐèÁô³ö¿Õ°×¶ÔÕÕ¿×(不加抗
原)
将已包被好抗原的酶标板用洗涤液(0.05%Tween-20-PBS T)浸洗三次
除盐分及多余抗原在37以封闭剩余的活性位点
将封闭好的酶标板用PBS-T溶液洗三次需设置空白对照(不加抗原和一抗)
然后放入37使一抗与抗原充分反应
将一抗孵育的酶标板用PBS-T溶液浸洗三次
置于37
5. 加入底物显色
再用双蒸水浸洗三次后
置于暗处反应5min
ÿ¿×ÖмÓÈë100µl 2M H2SO4终止反应
用Bio-Rad Microplate Reader-Model 550在492nm的波长下读板
(四) 阳性杂交瘤细胞的扩大及克隆化筛选
扩大培养由96孔板转至24孔板
再至培养瓶冻存保种
有限稀释法采用梯度倍数稀释的原则
然后接种于微孔培养板微孔中可出现单个克隆
1. 第一天置于5% CO2培养箱中培养
稀释杂交瘤细胞调整细胞浓度至A
第一步则1/A+10－(1/A)=104个/ml
ÔÙÈ¡ÉÏÊöÒºÌå0.1mlÔò103个/ml
ÔÙÈ¡ÉÏÊöÒºÌå0.1mlÔò102个/ml
ÔÙÈ¡ÉÏÊöÒºÌå0.1mlÔò10个/ml。