手性色谱柱知识介绍

手性色谱柱知识介绍
手性色谱柱（Chiral HPLC Columns）是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。

通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的。

要实现手性识别，手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种相互作用。

这种相互作用包括氢键、偶级-偶级作用、-作用、静电作用、疏水作用或空间作用。

手性分别效果是多种相互作用共同作用的结果。

这些相互作用通过影响包埋复合物的形成，特别位点与分析物的键合等而转变手性分别结果。

由于这种作用力较微弱，因此需要认真调整、优化流淌相和温度以达到最佳分别效果。

在手性拆分中，温度的影响是很显著的。

低温增加手性识别力量，但可能引起色谱峰变宽而导致分别变差。

因此确定手性分析方法过程中要考虑柱温的影响，确定最优柱温。

迄今为止，尚没有一种类似十八烷基键合硅胶（ODS）柱的普遍适用的手性柱。

不同化学性质的异构体不得不采纳不同类型的手性柱，而市售的手性色谱柱通常价格昂贵，因此如何依据化合物的分子结构选择适用的手性色谱柱是特别重要的。

依据手性固定相和溶剂的相互作用机制，Irving Wainer首次提出了手性色谱柱的分类体系：
第1类：通过氢键、-作用、偶级-偶级作用形成复合物。

第2类：既有类型1中的相互作用，又存在包埋复合物。

此类手性色谱柱中典型的是由纤维素及其衍生物制成的手性色谱柱。

第3类：基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。

这类手性色谱柱中最典型的是由Armstrong教授开发的环糊精型手性柱[2]，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）形成的手性色谱柱也属于此类。

第4类：基于形成非对映体的金属络合物，是由Davankov开发的手性分别技术，也称为手性配位交换色谱（CLEC）。

第5类：蛋白质型手性色谱柱。

手性分别是基于疏水相互作用和极性相互作用实现。

但由于市场上可选择的手性色谱柱越来越多，此分类系统有时很难将一些手性柱归纳进去。

因此参考Irving Wainer的分类方法，依据固定相的化学结构，将手性色谱柱分为以下几种：
刷（Brush）型或称为Prikle型
纤维素（Cellulose）型
环糊精（Cyclodextrin）型
大环抗生素（Macrocyclic antibiotics）型
蛋白质（Protein）型
配位交换（|Ligand exchange）型
冠醚（Crown ethers）型
刷型：
刷型手性色谱柱的消失和进展源于Bill Prikle及其同事的卓越工作。

六十年月，Bill Prikle将手性核磁共振中的成果运用到手性HPLC固定相讨论中，通过不断实践，创造了应用范围较广、柱效很好的手性色谱柱。

刷型手性色谱柱是依据三点识别模式设计的，属于Irving Wainer分类中的第一种类型。

刷型手性固定相分为电子接受型和电子供应型两类。

最常见的电子接受型固定相是由（R）-N-3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸键合到-氨丙基硅胶上的制成。

此类刷型手性色谱柱可以分别很多可供应电子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等对化合物进行衍生化后进行手性分别。

电子供应型固定相常见的是共价结合到硅胶上的萘基氨基酸衍生物，这种固定相要求被分析物具有电子接受基团，例如二硝基苯甲酰基。

醇类、羧酸类、胺类等，可以用氯化二硝基苯甲酰、异腈酸盐、或二硝基苯胺等进行衍生化后，用电子供应型固定相达到手性分别。

刷型固定相的优势在于其易于合成。

合成方法在Bill Prikle的著作中有具体的说明。

另外，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的选择因子。

它的不利之处在于它仅对芳香族化合物有效，有时不得不进行衍生化反应。

但值得一提的是，这种衍生化反应是非手性衍生反应，所以不存在手性衍生的问题。

刷型手性色谱使用的流淌相基本是极性弱的有机溶剂，这对于制备色谱来讲未必是缺点。

近来，刷型固定相消失了电子供应和接受基因的混合固定相。

如：WHELK-O和BLAMO，及-BURKE-Ⅱ固定相。

-BURKE-Ⅱ相非常适用于-阻
断剂的手性分别。

典型的流淌相为二氯甲烷-乙醇-甲醇混合物，比例为85：10：5。

加入10mM醋酸铵可以调整保留时间。

SS BLAMO Ⅱ，同时具有电子供体区和受体区，形成手性裂缝，因此对于某些分子具有很高选择性。

纤维素型：
纤维素型手性色谱柱的分别作用包括相互吸引的作用及形成包埋复合物。

它们属于Wainer分类中的第2种类型。

市售的手性色谱柱为微晶三醋酸基、三安眠香酸基、三苯基氨基酸盐纤维素固定相。

许多化合物可通过此类型的色谱柱得到分别。

这种类型的手性色谱柱种类也很齐全。

流淌相使用低极性溶剂，典型的流淌相为乙醇-己烷混合物。

但特殊要留意由于氯可以使纤维素从硅胶上脱落，因此要确保流淌相中无含氯溶剂。

这种类型的手性色谱柱主要的制造商之一是日本的Daicel公司，他们生产的纤维素酯和氨基甲酸纤维素柱可以分别多种生物碱和药物。

特殊值得一提的是OD柱。

在某手性化合物异构体的分别中，分别度超过了25，这意味着载样量可以很高，对于制备非常有利。

纤维素固定相的每个单元都为螺旋型，而且这种螺旋结构还存在极性作用、-作用及形成包埋复合物等手性分别因素。

淀粉代替纤维素制成的此类手性柱显示了和纤维素柱不同的选择性，但是稳定性较差。

由于淀粉是水溶性的，因此流淌相中必需肯定无水才能保证柱子寿命。

目前此类型的柱子能分别80%左右可能面临到的全部手性化合物。

此类柱子通常用于正相系统，用正己烷-乙醇，正己烷-异丙醇混合溶剂
为流淌相。

OD柱也可用于反相的状况，但流淌相必需含有高浓度的高氯酸盐缓冲液，以防止固定相溶解。

即使这样，使用较长时间以后色谱柱也难免要受到损害，但是在某些状况下使用反相系统分别效果要优于使用正相系统。

环糊精型：
环糊精是通过Bacillus Macerans 淀粉酶或环糊精糖基转移酶水解淀粉得到的环型低聚糖。

通过掌握环糊精转移酶的水解反应条件可得到不同尺寸的环糊精。

市售的环糊精主要是、、三种类型，分别含6、7、8个吡喃葡萄糖单元。

环糊精分子成锥筒型，构成一个地窖，地窖的孔径由构成环糊精的吡喃葡萄糖的数目打算。

环糊精类型及地窖的孔径等见下表：
环糊精糖元数目地窖孔径可进入地窖的分子类型手性中心数目
6 4.5-6.0 5-6元环的芳香族化合物30
7 6.0-8.0 联苯或萘35
8 8.0-10.0 取代芘和类固醇40
2，3位仲羟基分布在环糊精洞口，6位伯羟基在环糊精分子的外部，这意味着地窖内部是相对疏水的区域。

用环糊精手性固定相产生手性识别要求被拆分物的疏水部分能嵌入环糊精地窖中，形成可逆的、稳定性不同的包合物，环糊精洞口的羟基和被拆分物的极性基团相互作用。

由于形成包合物速度较慢，因此可能导致色谱峰峰形较差，同样也
影响了其在制备色谱中的应用。

环糊精固定相的选择性取决分析物的分子大小；-环糊精只能允许单苯基或萘基进入，-环糊精允许萘基及多取代的苯基进入，-环糊精仅用于大分子萜类。

-环糊精手性固定相应用范围最广。

Ibuprofen通过-环糊精色谱柱得到分别，说明白pH 值对氢键的影响。

当流淌相的pH=7时，观看不到拆分的迹象。

pH=4时，可达到好的分别效果。

通常分别氨基酸时，常采纳低的pH值，以抑制酸性基团的离子化，同时也增加氨基的质子化。

磷酸三乙胺盐、乙酸三乙胺盐证明对-环糊精色谱柱来说是很好的缓冲液。

通常缓冲液是0.1%三乙胺溶液，用磷酸或醋酸调整到合适的pH值。

高的流速会降低形成复合物的力量，低流速分别效果较好，0.5-1ml/min的流速最好。

另外，增加缓冲液的浓度可以克服流速的影响，由于它可以增加环糊精地窖和流淌相的吸引力。

常用缓冲液及其使用浓度如下表所示：
缓冲液浓度目的
TEAA（乙酸三乙胺盐）0.01-2%NH4NO3 10-500mM (用于减小包埋) 柠檬酸盐10-200mM (特殊适合于酸性化合物)
醋酸铵10-200mM
pH值选择见下表:
醇和胺pH4(加强NH的离子化)酸pH7
优化手性分别条件要考虑的方面有：pH值对分别度的影响；流速对分别度的影响；柱温、有机相比例、缓冲盐浓度对分别度的影响。

环糊精的修饰：最近，对环糊精的修饰使环糊精型手性色谱柱可以
分别更多的化合物，并可用于气相手性色谱分别。

衍生化是通过将不同的基因键合到环糊精地窖表面的羟基上。

衍生化反应包括乙基化、S-羟基丙基化、生成S或R-萘基乙基氨基甲酸盐、3，5二甲基苯基氨基甲酸盐和环状对甲苯酰酯。

这些新型的环糊精固定相有很多优点，它们可以分别更多化合物，价格上也有竞争力，由于改进了手性识别力量使其更适用于制备色谱。

配位交换型：
手性配位交换色谱（Chiral Ligand Exchange Chromatography，CLEC）由Davankov创造，是通过形成光学活性的金属络合物而达到手性分别，属于Irving Wainer分类中的第4类手性固定相，主要用于分别氨基酸类。

由于此类固定相是由手性氨基酸铜离子络合物键合到硅胶或聚合物上形成，因此流淌相中必需含有铜离子以保证手性固定相上的铜离子不至流失。

其它的过渡金属元素也已用于手性配位交换色谱，但铜离子应用最广。

形成络合物的过程非常缓慢，因此有时需提高柱温，最佳温度约50Ⅱ。

手性配位交换色谱仅对-氨基酸和其类似物有效。

-氨基酸很难用手性配位交换色谱得以分别。

手性配位交换色谱可用于制备，由于流淌相中存在铜离子，虽然铜离子能用离子交换柱除去，但增加了样品处理的困难。

大环抗生素型：
大环抗生素型手性色谱柱是最近进展起来的，通过将大环抗生素键
合到硅胶上制成的新型手性色谱柱。

大环抗生素型手性色谱柱的消失归功于Dan Armstrong的贡献。

此类色谱柱常用的大环抗生素主要由三种：利福霉素（Rifamycin），万古霉素（Vancomycin），替考拉宁（Ticoplanin）。

利福霉素作为手性添加剂在毛细管电泳分别手性化合物方面得到了胜利运用。

万古霉素和替考拉宁分子结构中存在"杯'状结构区和糖"平面' 结构区。

此类色谱柱性质稳定，可用于多种分别模式。

手性分别基于氢键、-作用、形成包合物、离子作用和肽键等。

替考拉宁分子量为1885，结构中存在20个手性中心，3个糖基和4个环。

酸性基团在多肽"杯'/ "裂层'的一端，碱性基团在它的另一端。

酸性基团和碱性基团供应了离子作用点。

糖基在三个平面上，可折叠起来将化合物分子包埋在多肽"杯'中。

万古霉素分子量为1449，结构中存在18个手性中心，3个环。

万古霉素具有"篮状'结构，它的四周还有一个可弯曲的糖平面，可将分析物分子包埋在"篮子'中。

羧基和仲氨基分布在"篮子'的边缘，参加和分析物分子产生离子作用。

万古霉素手性色谱柱可用于反相模式、正相模式和极性模式。

万古霉素手性色谱柱可以分别胺类、中性酰胺、脂类。

但对于酸性化合物选择性较低。

在反相模式中，有机相常用四氢呋喃、乙腈和甲醇。

水相常用三乙胺-乙酸缓冲液。

色谱柱适用的pH范围为4-7。

通常优化碱性化合物手性分别条件时，选择pH=7 为起点比较好。

另外四氢呋喃、乙腈有最好的选择性。

有时采纳纯的甲醇和乙醇作流淌相也可达到好的分别效果。

万古霉素手性色谱柱也可用正相模式，采纳正己烷/乙醇为流淌相。

万古霉素手性色谱柱载样量可以很大，特别适用于制备色谱。

蛋白质型：
蛋白质型手性色谱柱属于第5种类型。

分别依靠于疏水相互作用和极性相互作用。

已经有多种蛋白质用于此类手性色谱柱。

目前使用较多的是-酸性糖蛋白（-Acid Glycoprotein，AGP），人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA），牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和卵类粘蛋白（Ovomucoid，OV）。

-酸性糖蛋白分子由181个氨基酸残基和40个唾液酸（sialic acid）残基构成。

-酸性糖蛋白分子偏酸性，等电点为 2.7。

含有两个二硫键，性质很稳定。

-酸性糖蛋白分子可以共价键合到硅胶上，制成手性色谱柱，可以分别很多化合物。

-酸性糖蛋白手性色谱柱使用的流淌相通常为pH 4-7的磷酸盐缓冲液和很小比例的有机相。

有机相首选异丙醇，如达不到分别要求，可以尝试乙腈，乙醇，甲醇或四氢呋喃。

有机相的转变导致蛋白结构发生临时的转变。

色谱柱的负载量至关重要，典型的负载量为0.02mg/ml 的浓度样品，进样20l。

pH 的转变对手性选择性起关键作用，尤其是胺类化合物。

pH降低导致蛋白质负电荷的降低，引起胺类化合物保留时间减小，然而这意味着可以减小有机相比例，使选择性增加，峰形改善。

通过调整有机相比例仍无法达到分别效果时，有时需用电荷调整剂。

但这可能引起蛋白结构的永久转变，这些电荷调整剂包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。

有时也用到1，2 亚乙基二醇，1，2丁醇和氯化
钠。

温度对分别也有影响，温度增加保留时间，减小分别因子。

人血清白蛋白（HSA）分子量为69,000，等电点为4.8。

蛋白中认为存在两个药物结合位点：华法令-氮杂普鲁帕宗（warfarin-azapropazone）和苯基二氮杂-吲哚（benzodiazapine-indole）结合位点。

流淌相中加入辛酸，采纳人血清白蛋白手性色谱柱可以有效分别benzodiazapine。

Warfarin 和oxazepam也用人血清白蛋白手性色谱柱得到了分别，流淌相组成为：100mM磷酸缓冲液pH7：乙腈：异丙醇= 84：10：6。

牛血清白蛋白（BSA）为球型蛋白，分子量为66,000，等电点为4.7。

此蛋白为一个单氨基酸链，通过17个二硫键形成9个双环。

很多化合物通过牛血清白蛋白手性色谱柱得到分别。

牛血清白蛋白不如-酸性糖蛋白稳定，一些有机溶剂（如乙腈、甲醇）可使蛋白变性，因此使用起来要特殊留意。

卵类粘蛋白由蛋清中提取，分子量为55,000。

它可分别大量的胺类和酸类化合物。

蛋白手性色谱柱的载样量均较小。

影响了蛋白手性色谱柱在制备色谱中的应用。

蛋白手性色谱柱在全部手性色谱柱中是应用最广的色谱柱，但并不是效果最好的色谱柱。

冠醚型：
冠醚类固定相用于分别一级胺，一级胺必需质子化方能达到分别。

因此必需使用酸性流淌相，如高氯酸。

最常用的是冠醚类固定相是18-冠-6，已有商品化产品，由Daicel公司制造。

无论（+）或（-）型
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均可达到有效分别，并可通过变化（+）（-）类型而转变分析物出峰挨次。

冠醚作为添加剂也用于核磁共振和电泳，但由于其毒性较大，有致癌性，使其应用受到限制。

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