免疫组化技术要点与常见问题

免疫组化技术要点与常见问题
在免疫组化过程中，为了更好的说明问题和查找原因，最好设置阳性
对照片（已知的高表达相应抗原的组织）和阴性对照组织片（不加一
抗但是加二抗系统/不加任何抗体两组），所有操作过程应完全一致。

染色弱或者没有染色（按照先后顺序，先排除一些简单的原因）:
可能原因解决办法
试剂使用顺序错
误或者漏加试剂
重复实验，保证每一步均正确
二抗和一抗不匹
配
选择匹配的二抗
底物和酶不匹配选用匹配的底物
酶失活换用新的酶（将酶和底物混合，看是否显色？）
组织中没有待测
抗原表达或者表
达水平低
使用阳性对照片
抗体浓度太低增加抗体浓度.最好使用不同浓度的抗体，决定最
佳浓度
抗体孵育时间不
充分
延长抗体孵育时间
底物孵育不充分延长底物孵育时间
抗体储存不当，导致失效将抗体分装，低温保存 (-20 to -70 C) ，避免反复冻溶。

稀释抗体在4保存1-2周，避免时间过长。

或者根据说明书进行恰当的保存
一抗失效换用新的一抗
二抗失效换用新的抗体（能否成功与其它一抗配合？）脱石腊不充分延长脱腊时间或者换用新的二甲苯
组织固定不充分
或者不当
增加固定时间或者改用不同的固定方法
组织固定过度减少固定时间。

若已固定过度，则需使用正确的或
者推荐的抗原修复方法
复染试剂与底物系统不匹配选择正确的复染试剂（不加复染剂，看是否有组织染色？）
封片剂不正确选择正确的封片剂
染色背景高:
可能原因解决办法
洗片不充分每步之间至少洗片3次
组织含有内源性的酶，如HRP/AP 在加入一抗之前使用3％的H2O2甲醇封闭内源性HRP 活性，使用左旋咪唑(levamisole)溶液阻断内源性AP活性。

或者换用葡萄糖氧化酶系统
组织含有内源性生物素（尤其是肾脏、肝和脾）在加入一抗之前，血清封闭之后使用avidin/biot in阻断试剂。

或者避免使用biotin-avidin系统或改用IF方法(直接将酶和底物加到组织片上，看是否显色？)
一抗的非特异性
结合或者抗体浓
度过高
增加一抗的稀释度
二抗和组织非特异性结合使用与二抗来源相同的正常动物血清（一般是1 0％）封闭，必要时可以将血清浓度加大
组织固定不充
分，抗原扩散
Increase duration of postfixation
使用小鼠来源的
二抗检测小鼠组
织
在加一抗之前使用MouseOnMouse封闭试剂干片染色过程中避免出现干片现象
染色强度过大:
可能原因解决办法
一抗或者二抗浓度过高降低抗体浓度。

或者使用不同的浓度，决定最佳染色浓度
孵育时间过长减少孵育时间
孵育温度太高降低孵育温度，在4℃过夜或者37℃0.5-1小时
或者RT
底物孵育时间过长减少孵育时间
干片染色过程中避免出现干片现象。