植物抗病毒的可能机制-基因沉默

植物抗病毒的可能机制——基因沉默
植物抗病性是植物抵抗病原物侵染的性能。

1986年有人首次将烟草花叶病毒(TMV，下称)的衣壳蛋白(CP，下称)基因导人烟草获得了抗TMV转基因植株后，很多学者开展了转基因抗病毒的研究。

1990年Carylon等人首先报道了转基因沉默(Transgene silencing)现象。

基因沉默是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。

它发生在两种水平上，1种是转录水平上的基因沉默，另1种是转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing．PTGS．下称)。

转录后水平基因沉默在植物表现型上称为共抑制，是指在外源基因沉默的同时，与其同源的内源基因的表达也受到抑制的现象。

Carylon为加深花色将查尔酮合成酶基因(ehalcone synthase，CHS)转到紫花矮牵牛中，发现42％的转基因植株中不仅花色未加深，反而变为白色或紫白相间，这种转入的外源基因和内源基因共同沉默的现象就是转基因沉默。

目前认为．植物基因沉默是植物长期进化形成的用来防止外来遗传物质干扰自身基因组功能和保持稳定性的重要机制，是生物体中1种不完全的原始的生物免疫系统。

本文将从基因沉默的角度介绍植物抗病毒的可能机制。

1 RNA介导的病毒抗性和PTGS
近20年来，植物抗病毒基因工程的研究逐步深入。

在CP基因介导的抗性研究中，对CP基因进行改造，插入翻译终止密码子或去掉翻译起始密码子，使其不能翻译产生CP蛋白，结果也能获得高抗病甚至免疫的转基因植株。

这种病原来源的抗性称之为RNA介导的病毒抗性(RNA mediated virus re— sistance，RMVR．下称)。

RMVR与PTGS机制类似。

两者均发生在胞质中。

PTGS与RMVR两种现象具有许多共同特征，如序列特异性、与转基因的拷贝数有关，减数分裂后沉默保持的不可预见性(George，1998)，所以RMVR也是1种PTGS。

一般来说，以病毒的编码区DNA或 cDNA(完整的基因或基因的一部分，特别是基因的3’端)为转基因时就容易发生PTGS。

由于PTGS和 RMVR的共同特征和均通过目的RNA降解来实现的机制．所以有学者认为应将两者合称为"RNA沉默”。

2 RNA的特异性降解的抗病性机制
RNA介导的抗病性策略也就是将病毒的某一基因小片段转入到植物基因组中，通过一定方式激活植物潜在的基因沉默控制系统，从而对与该病毒区段序列同源的核酸(包括植物转录出来的mRNA和入侵病毒RNA)进行序列特异性降解，这样阻止了病毒的复制而产生病毒抗性。

转录后沉默表现的共抑制抗病性，其主要原因是RNA的特异性降解。

对这种降解的解释归纳起来有RNA 阈值模型和畸变RNA模式两类。

前者最早由Lindbo等提出，他们发现与定位在细胞质内的RNA 病毒同源的外源基因大量转录后，能够抵抗同源病毒的侵染。

外源基因过度转录或病毒基因组的大量复制，导致细胞内特定mRNA的积累。

当累积量超出植物基因组环境中的正常阈值时就诱发RNA降解。

这种反应只对共抑制mRNA特异降解．而对其他类型的mRNA无影响。

畸变RNA模式是指由于转基因的不完整性、排列方式以及DNA的甲基化等原因，在以转基因为模板合成mRNA 过程中．同时合成一些畸变(不完整)的RNA片段。

这些RNA片段被细胞内RNA聚合酶所识别，并以此为模板合成cRNA(互补或反义 RNA)，cRNA与完整的转基因mRNA或病毒RNA杂交。

形成双链结构。

这种双链结构被细胞内的 RNA降解体系所识别，并特异地将这些RNA降解。

不论外源RNA是单链，还是双链，最后都是以dsR． NA的形式被转变成2l一或23一核苷酸片段。

这
些短的RNA片段形成沃森一克里克碱基对结构，激活 RNA酶．并指导RNA酶去降解外源RNA和细胞内序列相似的RNAr41。

We-Scharf等人(2000年)的研究在一定程度上解释了从畸变RNA的降解到PTGS机制。

他们通过随机插人诱变。

分离出1个不发生RNA沉默突变体菌株mut-6．在该菌株中克隆了1个能编码RNA解旋酶的基因Mut-6。

该解旋酶可以使许多RNA病毒中的双链RNA解开螺旋。

反之，如果将dsRNA转入植物细胞后，可以促进RNA沉默。

3植物采用基因沉默的策略产生抗病性
Lindbo等人首次将PTGS和植物体内的病毒联系起来．他们发现病毒侵染转基因植物后，能诱发与病毒同源的转基因沉默。

沉默的激活伴随着寄主植物从原先的病毒感染中恢复，新生枝叶均无病状．且对同病毒的再次感染产生抗性。

至今RMVR已在多种病毒感染的双子叶植物和单子叶植物中获得结论性证明。

用携带绿色荧光蛋白(GFP)mRNA的马铃薯X病毒(PVX，下称)感染GFP转基因植物后，编码GFP的病毒RNA和高度表达的转基因RNA则均被降解。

1种病毒诱导的PTGS的抗病毒性可抵抗另1种具有同源基因的病毒．叶片的恢复与 RMVR的激活有关。

Baulcombe等人(1999)认为。

PTGS可能是植物抵抗病毒侵染的1种自然(本能)反应。

对1种病毒而言，大多数的植物是非寄主．即这些植物对这种病毒表现非寄主抗性。

非寄主抗性可能是病毒侵染植物后诱发的PTGS的极端反应。

自然界中植物病毒变异比较快，植物很难像抗真菌、细菌那样通过蛋白质之间的相互识别。

并经过一系列的信号传导激活防卫反应来产生抗病性，而是采用基因沉默的策略．直接对病毒核酸进行序列特异性降解来产生抗病性。

具有同源序列的不同病毒或同1病毒的不同株系共同侵染植物时。

产生的交互保护现象可能都与植物基因沉默有关。

由此可见，高等植物对病毒的抗性可能正是通过PTGS这一高度特异的细胞防卫机制来实现的。

一般来说，大多数的转基因植株都是感病的，只有少部分植株是高抗型和恢复型。

高抗型的植株一般在接种病毒之前便启动了PTGS。

这种PTGS是由转基因本身诱发的。

当接种病毒后，细胞内某种(些)酶能特异识别侵入的病毒基因组RNA，并将其降解，转基因植株表现出高度抗病，植株无病状，也检测不到病毒。

恢复型的植株在接种病毒前并未表现 PTGS。

PTGS是由于接种病毒后诱导产生的。

这种转基因植株开始表现症状，病毒能在植株体内增殖和运转。

但经过一段时间后，新生叶片的症状开始减轻，甚至完全不表现症状。

随后再接种也表现出高度抗病．在这些新长出的无症叶片内也检测不到病毒的增殖。

4植物病毒克服基因沉默产生致病性
植物利用基因沉默对病毒产生抗性．病毒也能编码某种特异的蛋白质抑制寄主植物PTGS。

这种蛋白质称为PTGS的抑制子(Suppressor)。

目前已在多种病毒中发现能编码抑制植物PTGS的蛋白质。

PTGS抑制子可能存在不同的作用方式．有的抑制 PTGS的启动(如CMV的2b蛋白)，有的则抑制PT- GS的保持(如PVY的HC Pro 蛋白)。

Voinnet等最近发现．在12个受试病毒中有8个能够在烟草中抑制PTGStSl，暗示着抑制PTGS是病毒对抗寄主防卫机制的策略。

两种病毒复合侵染产生的症状和损害重于单独侵染的现象．可能是其中1种病毒编码的抑制子蛋白抑制了PTGS所致。

5寄主植物与病毒的共同进化
植物以基因沉默的策略抵抗病毒的侵染，病毒克服基因沉默侵染寄主。

植物与病毒之间的这种关系，可能是协同进化的结果。

病毒为有效地利用寄主的复制和转录因子．会将其遗传物质整合到寄主植物染色体上。

植物可能通过甲基化或后成修饰将病毒基因封闭，抑制其表达，或通过排异作用使病毒基因不能完整整合来保护自身，植物借此进化产生了PTGS的防卫机制。

迫于生存压力。

病毒在进化过程中实现快速传播或产生沉默抑制物。

对抗植物的PTGS防卫机制，使病毒能够在植物体内继续生存、繁衍。

1995年Ding等人提出CMV 2b蛋白是寄主防病体系的抑制因子。

现有研究表明，CMV的2b蛋白质是被运转到细胞核内而起作用的(Lucy．2000)．在进行CMV 2b基因和其他4个CMV基因的比较中。

发现CMV 2b基因代表了1个新进化的基因(Ding，1994)，这暗
示着CMV 2b基因是病毒对植物抗病防御体系的适应。

由转基因技术导入植物体内的外源基因，同样可能会被植物防卫机制当作“入侵病毒”，而启动植物抗病毒机制。

将其封闭或降解。

6基因沉默技术在植物抗病毒上的应用及前景
在植物的防卫机制中．一些具有特殊功能的基因起着重要作用。

利用病毒诱导基因沉默机制可以在较短时间内鉴定1种植物的多个基因的功能。

在植物抗病机制的研究和转基因抗病育种中，可以鉴定和利用一些与抗病反应和识别病原有关的一些基因。

如现已从马铃薯中分离出Rx 和Rv抗病基因。

由于RMVR具有抗病性强、抗性持久、生物安全性高等特点，所以在植物抗病毒基因工程中有无法比拟的优势。

尽管RNA介导的病毒抗性的范围较窄，但产生抗性所需要的有效核酸片段较小，最短只需0．1 kb，因而可将不同病毒的最短有效核酸片段 cDNA剪接起来，构建于同1载体中转入植物来扩展抗性范围，也可将同1病毒不同的最短有效cD— NA片段组合连接起来，以增强抗病性和提高抗病持久性。

这样获得的转基因植物不但具有高的病毒抗性，而且还可以同时抗几种病毒。

因此，深入研究基因沉默不仅对解释抗病毒的机制有重要的理论意义，而且对彻底解决植物病毒问题有较大的潜在实用价值。