病毒类疫苗生产与质量控制要求

病毒类疫苗生产与质量控制要求
2012.7.18
病毒类疫苗
以病毒或病毒某种抗原成分为原料，可分为：
►减毒活疫苗：麻疹、风疹、腮腺炎等
病毒性疫苗工艺流程简述
澄清过滤（提三级种子库澄清、过滤（提减毒活疫苗
三级细胞库内容
1.灭活疫苗
病毒性灭活疫苗优缺点
灭活疫苗的优点
1、所用生产毒种不必需要减毒或弱毒株；
2、必须使用灭活剂灭活病毒；因此，可以灭活可能的外源因子；
病毒性灭活疫苗关键点灭活疫苗的关键点：
原始种子主种子病毒种子批系统原始种子和主种子要求冻干保存于
－20℃；
工作种子可以液体保存于－60 ℃以下，一般不超过2病毒性灭活疫苗关键点1(病毒种子)
下，般不超过年；
细胞库
原材料
•不得使用神经系统来源的细胞；
•细胞培养液：不得含有人血清；
•胰蛋白酶检测：应证明无细菌、真菌、支原体或病毒污染，特别是检测胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒，如猪细小病毒等；
•抗生素：不得使用青霉素或β-内酰胺类抗生素
原代细胞
地鼠肾细胞
中国药典（2010年版三部）
灭活疫苗的动物细胞应来自封闭式房所内饲养的动物，并须检测与使用动物相
病毒性灭活疫苗关键点2-1 生产用基质细胞原代动物细胞我国目前用原代细胞生产的疫苗：
病毒性灭活疫苗关键点2-2 生产用基质细胞或动物
原代细胞的要求
•对动物脏器组织或胚胎来源的动物应有明确健康状况和洁净级别要求；
不能建立细胞库只能限于原始培养的细胞或传代少数几•不能建立细胞库，只能限于原始培养的细胞或传代少数几原代细胞：地鼠肾、沙鼠肾
优点：✶来源容易，动物的繁殖快，4-5周出现性周期，怀孕期15-18天，哺乳期20
天产后2436小时即可发情排卵年可产810胎
生产用细胞
天，产后24-36小时即可发情排卵，一年可产8-10胎。

连续传代细胞系的特殊要求
•生产用细胞代次：最高代次须符合要求(或经批准)；
人二倍体细胞株的特殊要求
•新建的人二倍体细胞株（资料：建立细胞株所用胎儿的胎龄和性别、终止妊娠的原因、所用胎儿父母的年龄、职业及健康良好的证明，以及胎儿父系及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史的书面材料）
•：对新建、遗传修饰的细胞株需要；对已建株如2BS、MRC5等，在建立MCB时可染色体检查：对新建遗传修饰的细胞株需要；对已建株如2BS MRC-5等在建立MCB时可
二倍体细胞2BS
MRC-5传代细胞Vero 1、冻存于液氮
2、一式两份保存
病毒性灭活疫苗关键点2-3 生产用基质细胞,传代细胞库
式两份保存
二倍体细胞
具有正常二倍体（2n）染色体的数目，核型正常；
病毒性灭活疫苗关键点2-4 传代细胞库
——取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，
经复苏、扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产病毒性灭活疫苗关键点2-6 传代细胞库
经复苏、扩增后的细胞仅用于批疫苗的生产
Vero细胞用于疫苗生产的优缺点
病毒性灭活疫苗关键点2-5 传代细胞库
优点：缺点缺点：
Vero细胞疫苗的研究
V 细胞的来源和历史
生产用细胞
Vero细胞的来源和历史Vero细胞的致肿瘤性
Montagnon实验：用裸鼠进行肿瘤实验，106或107细胞注射裸鼠，
同时用H l 细胞作对照
生产用细胞
同时用Hela细胞作对照
Vero 细胞残余DNA 的致瘤性
质量标准：80年代美国FDA → 10pg /剂
生产用细胞
欧盟、WHO → 100pg /剂
细胞毒种处理动物，选取所用组织
清洗组织，剪碎，用自然沉降法清洗毒种检定浸泡清除牛血清
抗菌素接种
传代细胞工作库细胞复苏
病毒性灭活疫苗关键点3-1 生产工序和/或步骤
洗换
柱层析单柱、多柱区带离心
其它方法纯化
无菌试验
抗原含量测定
蛋白量测定
牛血清白蛋白
DNA
病毒性灭活疫苗关键点3-2 生产工序和/或步骤福尔马林甲醛甲醛溶液（浓度定义）病毒性灭活疫苗关键点4-1 灭活剂和灭活方法
病毒性灭活疫苗关键点4-2 灭活剂和灭活方法
注意点：pH、温度、浓度和作用时间
优点：价廉、灭活方法简单易操作
缺点：残余甲醛的形式不变，使疫苗的稳定性差，注射时局部疼痛。

病毒性灭活疫苗关键点4-3 灭活剂和灭活方法
丙内脂：易水解、须使用95％以上
作用原理：直接作用于病毒的DNA或RNA ，打断病毒的核酸,使其不能复制遗传物
背景：目前细胞培养的疫苗基本均为纯化疫苗，要求的抗原量大，一般须
有病毒抗原的浓缩工艺；
病毒性灭活疫苗关键点5 浓缩
纯化－柱层析
设备、条件较简单，规模可大可小，价格低廉； 已有电脑程序控制，操作简单，放大不走样；
优病毒性灭活疫苗关键点6-1 纯化方法和纯度要求
纯化－超速离心
病毒性灭活疫苗关键点6-2 纯化方法和纯度要求
原理：由于病毒粒子已经小到在悬液或胶体溶液中不能自然沉降，离
牛血清：－应使用来源于经达标检查合格的企业之牛血清；
－质量应符合《中国药典》（三部2010版）有关牛血清的标准；
－特别是支原体、大肠杆菌噬菌体、及相关的病毒应检测阴性；
－生产乙脑疫苗时还须注意抗乙脑病毒的抗体应阴性病毒性灭活疫苗关键点7 疫苗的添加剂
生产脑疫苗时须注意抗脑病毒的抗体应阴性
病毒性灭活疫苗关键点8 疫苗的添加剂
防腐剂
硫柳汞：常用浓度0.01% ，易溶于水。

病毒性灭活疫苗关键点10 生产设施和厂房
1、生产过程和生产厂房要求控制严格；
毒种检定
鉴别试验
病毒滴度
疫苗生产过程质量控制
细胞制备
应留取一定比例的正常细胞做对照，并进行外源因子检查。

病毒接种和培养
毒种与细胞按一定的比例进行接种
病毒收获液
疫苗生产过程质量控制
成品检定
✓鉴别试验
✓外观检查
✓装量
1. 病毒种子属于已建毒种，是否建立三级种子批系统，疫苗生产使用工作种子批；如属于新建毒种则毒种分离、原始毒种库的建立、三级库的建立及检测是否符合要求？
2. 传代细胞是否建立三级（二级）种子库系统，疫苗生产使用工作种子库细胞；
3. 是否按规定的工艺，尤其是当转瓶培养而多瓶染菌是否继续转入下步工序？
4. 原代细胞生产疫苗时的单一收获液如何合并？
传代细胞生产疫苗时是否存在细胞的横向传代？
灭活疫苗生产程序关注点
5. 传代细胞生产疫苗时是否存在细胞的横向传代？19. 如使用生物反应器生产疫苗，如何确定对照细胞比率，如何确定“与接种病毒的细胞在相同条件下培养”的要求？
灭活疫苗检定程序关注点
1. 细胞培养用牛血清的检定项目；
2. 消化细胞用胰酶的检定项目；
3. 效力试验用所取的亚批能否代表整批疫苗？
内容
1.灭活疫苗
病毒减毒活疫苗
是将分离到的病毒，应用理化因素、生物学方法（如连续通过易感性较低的动物或组织培养传代）、或其它经人工诱导的方法，促使产生
病毒减毒活疫苗的基本要求
接种人体后，在适当的组织系统中产生一定的或短暂的增殖，引起隐性感染或类似一次轻型的人工自然感染过程，但不会发病。

能引起与疾病相类似的免疫应答（产生相应的体液免疫和/或细胞免疫
减毒活疫苗用毒种的基本要求
毒力必须减弱至对动物没有致病力，且增殖能力强。

每种减毒活疫苗生产用毒种对其减毒指标都应有明确要求和规定。

减毒活疫苗用毒种的基本要求
经临床研究证明安全有效。

所用毒种应无外源因子污染。

制备病毒减毒活疫苗的细胞基质
SPF原代鸡胚细胞：来源于无特定病原体鸡群的鸡胚制成的细胞。

原代动物细胞：来源于正常健康的动物机体组织，用酶分散剂使成单颗，不经传代的细胞。

如原代兔肾、猴肾、地鼠肾细胞。

制备病毒减毒活细胞基质要求
细胞系/株来源资料
✓人源细胞基质：具有组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及生理状况的相关资料。

制备病毒减毒活细胞基质要求
细胞库的建立
细胞库为三级管理，即原始细胞库、主细胞库及工作细胞库
✓原始细胞库
制备病毒减毒活细胞基质要求
细胞库检定
✓细胞鉴别试验
✓细菌、真菌检查
细菌真菌检查
举例------MMR疫苗
麻疹-腮腺炎-风疹三联减毒活疫苗，简称麻腮风三联减毒活疫苗，又称MMR疫苗。

我国麻疹、腮腺炎和风疹疫苗生产用病毒株
麻疹疫苗病毒株
✓沪191株：1960年11月上海麻疹流行时，由上海生物制品研究所从一麻疹病儿分离到病毒，经原代人胚肾细胞传33代、原代人羊膜细胞传39代、原代鸡胚细胞传至10代减毒成功。

1966年通过国家检定批准为麻疹活疫苗生产用毒种。

毒种批的检定
检验项目检验方法质量标准
鉴别试验微量中和法疫苗病毒应被相应的抗血清中和，不应有其他病变出现。

无菌检查培养法应无菌生长
支原体培养法应无支原体生长
疫苗生产用细胞基质
麻疹减毒活疫苗：SPF鸡胚细胞
腮腺炎减毒活疫苗：SPF鸡胚细胞
MMR疫苗生产
原液制备
按麻疹、腮腺炎、风疹单价疫苗的生产工艺和标准，生产和检定单价原液。

半成品配制
疫苗生产过程质量控制
细胞制备
应留取一定比例的正常细胞做对照，并进行外源因子检查。

病毒接种和培养
疫苗生产过程质量控制
成品检定
✓鉴别试验
✓外观检查
疫苗制备工艺的基本要求
按“国家”批准的生产工艺和质量标准进行生产
疫苗生产车间应符合GMP的要求。

疫苗制备工艺的基本要求
生产疫苗用细胞基质应无外源因子污染。

同批号制品的亚批应来源于同最终容器，同性质（均性）的半成品。

同一批号制品的亚批应来源于同一最终容器，同一性质（均一性）的半成品。

活疫苗制备场所的要求
生产减毒活疫苗的工作场所应与其他实验室隔离；
储存活疫苗毒种的冷库、冰箱不得存放其他微生物，尤其不能存放致病性微生物；
病性微生物
活疫苗制备工作人员的要求
凡从事减毒活疫苗工作的人员应经过健康检查，
生产阶段
疫苗/生产用原料
麻疹疫苗腮腺炎疫苗风疹疫苗
二倍体细胞疫苗生产用原/辅料
细胞基质SPF鸡胚细胞SPF鸡胚细胞
原代兔肾细胞
麻疹、腮腺炎减毒活疫苗工艺流程图
对照细胞
检定
制备细胞悬液
SPF鸡胚（9-11日龄）病毒工作
种子批
工作种子批检定
风疹减毒活疫苗工艺流程图
细胞生长成致密单层
细胞检定：对照细胞外源因子检查人二倍体细胞复苏、传代工作种子检定：
无菌检查、支原体检查
病毒滴定、鉴别试验
病毒工作种子批
接种病毒，30℃-32℃培养
内容
1.灭活疫苗
重组疫苗
采用基因工程技术，将目标蛋白的编码基因（DNA）通过质粒或者病毒载体，转化（转染）适宜的宿主菌或细胞系，目标基
重组细胞的特殊要求
•重组细胞系的建立应具有细胞基质构建方法的相关资料，如细胞融合、转染、筛选、集落分离、克隆、基因扩增及培养条件等方面；
基因工程疫苗构建
转化（转染）
基因工程乙肝疫苗
上市乙肝疫苗主要厂家及表达系统主要技术代表厂家
不同基因工程乙肝疫苗表达系统特点
CHO细胞系统：
优点：HBsAg能分泌到细胞外，培养上清可多次收获，提纯较容易，设备要求简单，易小量生产
求简单易小量生产
乙肝酵母疫苗主要质控点
菌种培养物纯度质粒保有率
三级菌种管理
原始菌种号: 2150-2-3(PHBS56-GAP347/33)
重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)工艺路线及质量控制点摇瓶培养种子罐培养发酵罐培养细胞收获细胞破碎
硅胶吸附浓缩微过滤去除碎片
培养物纯度
质粒保有率
超滤去除小分子主要原辅料
工作种子批质量控制点
发酵（举例:酿酒酵母工艺）
0.25L摇瓶培养17～19 小时
2*2L 摇瓶培养17～19小时
70L发酵罐培养16～22 小时A660:7.28
纯化
1.细胞破碎得到细胞匀浆
高压匀浆器以15000±500 PSIG的压力破碎酵母菌1～2次,微过滤（孔径为0.45 µm）以除去细胞碎片，超滤以除去小分子物质。

去细胞碎片超滤以除去小分子物质
配制
（1）灭活：在纯化产物中加入适量甲醛溶液使其甲醛含量达到
保温定时间
0.01%，36±2℃保温一定时间
成品制备
分批
应符合现行版《中国药典》三部“生物制品分批规程”规定。

重组酵母乙肝疫苗生产工艺、质控简述-1
National Institutes for Food and Drug Control
重组酵母乙肝疫苗生产工艺、质控简述-2
National Institutes for Food and Drug Control
二、种子批的制备和检定检查
项目要求
种子批的建立原始种子批三级管理
没有更换主种子批
酿酒酵母乙肝疫苗主种子批
三、疫苗原液及半成品制备和检定检查
项目要求
发酵
主要成分与批准组成致
酿酒酵母乙肝疫苗
培养基主要成分与批准组成一致
半成品
吸附完全性
硫氰酸盐含量Triton X-100含量pH 吸附率应不低于95 %
应低于1.0 µg/ml
应低于15.0 µg/ml
为5.5-7.2
酿酒酵母疫苗
三、疫苗原液及半成品制备和检定检查
游离甲醛含量应低于20.0 µg/ml
对CHO乙肝疫苗细胞库的要求C28主细胞库传代应不超过第21代
CHO乙肝疫苗主要质控点
1.细胞库的检定
2.工艺细胞培养对培养基,表达量的要求
离心
层析
CHO乙肝疫苗生产工艺、质控简介-1
National Institutes for Food and Drug Control
CHO乙肝疫苗生产工艺、质控简介-2
二、细胞库的制备和检定检查
项目要求
细胞库的建立原始细胞库三级管理
没有更换主细胞库
CHO疫苗
主细胞库
三、疫苗原液及半成品制备和检定检查
项目要求
原液
细胞制备
培养基
收获物检定主要成分与批准组成一致
CHO疫苗
对照细胞病毒外源因子检查
四、成品生产和检定检查
项目要求
成品
CHO疫苗
证明为HBsAg
不同表达系统表达HBsAg的特点
1.肽谱：HBsAg由约100个单体多肽组成的蛋白。

酵母抗原无糖基化，CHO抗原糖基化的比例最大。

2.表达方式
表达方式
不同种类乙肝疫苗的特点总结
酵母疫苗（Merck工艺）CHO疫苗血源疫苗汉逊疫苗糖基化程度无高低无
小结
种子的质细胞
扩大
培养过
程的检
配制
过程
监测
方法
分装
、包
量控培养测与工的检的规
装过
谢谢。