分子生物学第05章核酸的分子操作

Ⅱ型限制性内切酶的特点
Ⅱ 型酶分子量小， 为单亚基多体酶（ 同源二聚 型酶分子量小 ， 为单亚基多体酶 （ 为辅助因子，只有切割作用， 体），以Mg2+为辅助因子，只有切割作用，没有修饰 作用（有独立的与之相匹配的甲基化酶） 作用（有独立的与之相匹配的甲基化酶）。Ⅱ型酶的 识别序列一般为4~6个bp,切割位点在识别序列内或相 个 切割位点在识别序列内或相 识别序列一般为 邻处（ 型 邻处（Ⅱs型，shifted cleavage），见表 －2。切割位 ） 见表5－ 。 点在识别位点相邻处的例子如HgaⅠ，其识别序列和 Ⅰ 点在识别位点相邻处的例子如 切割位点记为GACGC（5/10），表示切割位点为 （ 切割位点记为 ） 5＇ G A C G C N N N N N↓ 3＇ ＇ ＇ 3＇ C T G C G N N N N N N N N N N↑ 5＇ ＇ ＇
流感嗜血杆菌（ 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）Rd株：HindⅢ ） 株 Ⅲ 大肠杆菌（ 大肠杆菌（Escherichia coli）Ry13株：EcoRⅠ ） 株 Ⅰ 淀粉液化芽孢杆菌（ Ⅰ 淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）H株：BamHⅠ ） 株
琼脂糖
150 bp 100 bp 65 bp 45 bp 20 bp 15 bp
聚丙烯酰胺
DNA大小与迁移距离的关系
在一定范 围内，DNA分 围内， 分 子迁移的距离 与其核苷酸对 （bp）的对数 ） 成反比。 成反比。
DNA分子的状态与 迁移速度的关系
在 无 EB 下 电 泳 ， cccDNA 泳 动 速 度 最 快 ， linear DNA次之 ， ocDNA最慢 。 随着 浓度的增加 ， 更多的 次之， 最慢。 浓度的增加， 次之 最慢 随着EB浓度的增加 EB结合到 结合到DNA上， cccDNA分子的负超螺旋逐渐解开， 分子的负超螺旋逐渐解开， 结合到 上 分子的负超螺旋逐渐解开 其分子半径增加，迁移速率减小。 其分子半径增加，迁移速率减小。达到游离染料的临界 浓度时， 不再有超螺旋， 浓度时 ， 不再有超螺旋 ， cccDNA分子的迁移速率达最 分子的迁移速率达最 小值。 继续增加EB， 便形成正超螺旋， 小值 。 继续增加 ， 便形成正超螺旋 ， DNA分子变得 分子变得 更加致密， 迁移速率迅速增加。 对绝大多数cccDNA分 更加致密 ， 迁移速率迅速增加 。 对绝大多数 分 子而言，游离EB的临界浓度介于 的临界浓度介于0.1～ 子而言，游离 的临界浓度介于 ～0.5µg/ml。由于电 。 荷的中和，以及EB赋予 赋予DNA较大的刚性， 随着 浓度 较大的刚性， 荷的中和 ， 以及 赋予 较大的刚性 随着EB浓度 的增加， 的增加 ， linearDNA和 ocDNA的迁移速率也有不同程度 和 的迁移速率也有不同程度 的减小。 的减小。
各种类型限制性内切酶的性质比较
性 质
蛋白质结构和 功能 识别部位 切割部位 限制作用所需 的辅助因子
Ⅱ 型基组成的 双功能酶
Ⅰ 型
由3个亚基组成的 个亚基组成的 复合功能酶
短小序列（大多为 短小序列（大多为4~6 5~7bp的不对称序 不对称序列，例如 的不对称序 不对称序列， bp），常为回文结构 ），常为回文结构 ）， 列 （AACN6GTGC)* 同于或接近于 识别部位 Mg2+ 距识别位点3’端 距识别位点 端 24~26bp处 处 ATP、Mg2+、S、 腺苷甲硫氨酸 非特异性， 非特异性，距识别 部位大于1000bp 部位大于 ATP、Mg2+、S-腺 、 腺 苷甲硫氨酸
限制性内切酶的发现
20世纪 年代初有两个实验室在研究噬菌体的 世纪50年代初有两个实验室在研究噬菌体的 世纪 宿主范围时相继发现，当一个噬菌体从其天然宿主， 宿主范围时相继发现，当一个噬菌体从其天然宿主， 的品系A，转到另一个品系B时 如E. coli的品系 ，转到另一个品系 时，往往不能 的品系 生长。但如果进行大量的感染， 生长。但如果进行大量的感染，则有个别噬菌体能 生存下来。研究表明， 生存下来。研究表明，噬菌体在非天然宿主品系中 不能生存，是因为噬菌体的DNA被降解了，而细菌 被降解了， 不能生存，是因为噬菌体的 被降解了 自身的DNA却不被降解。为了解释这种现象，人们 却不被降解。为了解释这种现象， 自身的 却不被降解 提出了限制－修饰酶假说。 提出了限制－修饰酶假说。
BamHⅠ G↓GATCC Ⅰ BglⅡ A↓GATCT Ⅱ BclⅠ T↓GATCA Ⅰ Sau3AⅠ ↓GATC Ⅰ
同尾酶切割后连接的结果
Ⅱ型限制性内切酶 所需反应条件
反应温度和时间： ℃保温适当长的时间， ① 反应温度和时间：37℃保温适当长的时间，保 温时间一般从半小时到数小时， 温时间一般从半小时到数小时， 可通过预备实验 确定或按文献资料进行。 确定或按文献资料进行。 反应体积：一般为几十µl。 ② 反应体积：一般为几十 。 底物DNA：用无 ③ 底物 ：用无DNase的RNase除去可能污染 的 除去可能污染 的RNA；用乙醇多次沉淀可除去各种杂质（如酚、 ；用乙醇多次沉淀可除去各种杂质（如酚、 SDS、 EDTA等 ） ， 最后吹干乙醇并溶于适当的 、 等 缓冲液中。 缓冲液中。
限制性内切酶的命名
第一个大写字母（斜体） 第一个大写字母（斜体）为产酶微生物属名的第 一个字母，第二、三两个小写字母（斜体） 一个字母，第二、三两个小写字母（斜体）为种名的 前两个字母，第四个大写或小写字母（正体）为变种 前两个字母，第四个大写或小写字母（正体） 或株系名的第一个字母，最后的罗马数字为序号（ 或株系名的第一个字母，最后的罗马数字为序号（从 同一种微生物中分离出了几种限制性内切酶时按发现 和分离的先后顺序编号） 和分离的先后顺序编号）。
限制－修饰假说图示
有A甲基 甲基 化酶和A 化酶和 限制酶 有B甲基 甲基 化酶和B 化酶和 限制酶
完全甲基化和不完全甲基化
一条链上甲基化而另一条链上没有甲基化的称 为不完全甲基化（ 如刚经过半保留复制的DNA分 为不完全甲基化 （ 如刚经过半保留复制的 分 两条链都甲基化的称为完全甲基化。 子），两条链都甲基化的称为完全甲基化。DNA甲 甲 基化酶可以对非甲基化的及不完全甲基化的识别序 列进行甲基化。 列进行甲基化。 1968年从大肠杆菌中发现了Ⅰ型限制性内切酶， 年从大肠杆菌中发现了Ⅰ型限制性内切酶， 年从大肠杆菌中发现了 1970年分离出了Ⅱ型限制性内切酶，从而证实了上 年分离出了Ⅱ型限制性内切酶， 年分离出了 述假说。 述假说。
表5－2 部分Ⅱ型限制性内切酶及其切割位点 － 部分Ⅱ
酶
EcoRⅠ Ⅰ Hae Ⅲ Mbo Ⅰ Pst Ⅰ
盐浓度
高 中 高 中
温度
37 ℃ 37 ℃ 37 ℃ 21~37 ℃
识别序列及 切割位点
G↓AATTC (5’ 突出粘性末端） 突出粘性末端） GG↓CC 平端） （平端） ↓GATC 突出粘性末端） （5’ 突出粘性末端） CTGCA↓G 突出粘性末端） （3’ 突出粘性末端）
溴化乙锭结构式
表5－3 凝胶浓度与 － 凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围 分子的有效分离范围
凝胶种类 凝胶浓度 （%） ）
0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 2.0 3.5 5.0 8.0 12.0 20.0
分离线性DNA的 的 分离线性 二甲苯青 溴酚蓝 有效范围
5 ~ 60 kb 1 ~ 20 kb 0.5 ~ 7 kb 0.4 ~ 6 kb 0.2 ~ 4 kb 0.1 ~ 3 kb 100 ~ 2000 bp 80 ~ 500 bp 60 ~ 400 bp 40 ~ 200 bp 6 ~ 200 bp 460 bp 260 bp 160 bp 70 bp 45 bp 1000 bp
Ⅱ型限制性内切酶 所需反应条件
反应系统：缓冲液应过滤除菌或高压灭菌， ④ 反应系统：缓冲液应过滤除菌或高压灭菌，根 据不同的限制性内切酶选择高、 低盐浓度。 据不同的限制性内切酶选择高、中、低盐浓度。 当用两种以上的限制性内切酶切割时，应先用需 当用两种以上的限制性内切酶切割时， 低盐浓度的酶，再用需高盐浓度的酶。 低盐浓度的酶，再用需高盐浓度的酶。所加酶量 要适当。 单位酶的定义 在限定的温度（ 单位酶的定义： 要适当 。 1单位酶的定义 ： 在限定的温度 （ 一般 为37℃）和缓冲液条件下，在20µl反应液中，1小 ℃ 和缓冲液条件下， 反应液中， 小 反应液中 时消化1µg DNA所需的酶量。 所需的酶量。 时消化 所需的酶量
限制－修饰假说
限制－修饰假说认为，细菌细胞中含有两种酶， 限制 －修饰假说认为 ， 细菌细胞中含有两种酶 ， 一种是限制性核酸内切酶，一种是 甲基化酶， 一种是限制性核酸内切酶，一种是DNA甲基化酶，这 甲基化酶 两种酶成对出现，二者对 分子有相同的识别序列。 两种酶成对出现，二者对DNA分子有相同的识别序列。 分子有相同的识别序列 DNA甲基化酶在识别序列处特定的核苷酸上甲基化。 DNA甲基化酶在识别序列处特定的核苷酸上甲基化。 甲基化酶在识别序列处特定的核苷酸上甲基化 限制性内切酶只能切割非甲基化的DNA，而不能切割 ， 限制性内切酶只能切割非甲基化的 不完全甲基化和完全甲基化的DNA。因此，非甲基化 。因此， 不完全甲基化和完全甲基化的 的外来DNA会被限制性内切酶降解。 会被限制性内切酶降解。 的外来 会被限制性内切酶降解
工具酶的来源
这四大类酶大都是从细菌和噬菌体中纯化出来的， 这四大类酶大都是从细菌和噬菌体中纯化出来的， 在细胞中它们原本就参与DNA复制、RNA转录、降解 复制、 转录、 在细胞中它们原本就参与 复制 转录 外来核酸分子、修复突变的DNA分子和不同 分子和不同DNA分子 外来核酸分子、修复突变的 分子和不同 分子 间重组等一系列重要的生命反应过程。在重组DNA技 间重组等一系列重要的生命反应过程。在重组 技 术中，它们被用来在人工控制的条件下（体外）工作。 术中，它们被用来在人工控制的条件下（体外）工作。 值得一提的是， 值得一提的是，绝大多数这类酶促反应是无法用其它 方法来替代完成的， 方法来替代完成的，这种不可替代性使这些工具酶在 重组DNA技术中占据了极其重要的地位。 技术中占据了极其重要的地位。 重组 技术中占据了极其重要的地位
核酸的凝胶电泳
为了检测酶切后DNA片段的大小 ， 必须进行凝 片段的大小， 为了检测酶切后 片段的大小 胶电泳分离。 胶电泳分离 。 往电泳体系中加溴化乙锭或电泳结束 后用溴化乙锭染色， 就可以在紫外光下看到DNA带 ， 后用溴化乙锭染色 ， 就可以在紫外光下看到 带 灵敏度可达5ng。RNA电泳也可用溴化乙锭染色，但 。 电泳也可用溴化乙锭染色， 灵敏度可达 电泳也可用溴化乙锭染色 灵敏度低得多。 灵敏度低得多。 DNA凝胶电泳常以琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 凝胶电泳常以琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 胶为介质， 前者用于较大片段的分离， 胶为介质 ， 前者用于较大片段的分离 ， 后者用于较 小片段的分离和序列测定。 小片段的分离和序列测定。
同裂酶和同尾酶
具有相同识别序列的酶称为同裂酶 （ isoschizomers） ， 切割位点可以相同也可以不 ） 同。如MboⅠ和Sau3AⅠ的识别序列和切割位点均 Ⅰ Ⅰ 为 ↓ GATC ， XmaⅠ 的 识 别 序 列 和 切 割 位 点 为 Ⅰ C↓CCGGG， 而具有与其相同识别序列的 ， 而具有与其相同识别序列的SmaⅠ Ⅰ 的切割位点为CCC↓GGG。 的切割位点为 。 识别序列不同， 识别序列不同 ， 但切出的粘性末端相同的酶 称为同尾酶（ 称为同尾酶（isocaudamers）。例如 ）
切割产生的末端
---G AATTC-----CTTAA G-----GG ---CC -----CTAG CC--GG--GATC-----
---CTGCA G-----G ACGTC---
限制性内切酶切割 位点的多寡
如果DNA上的核苷酸顺序是随机的， 则对于 上的核苷酸顺序是随机的， 如果 上的核苷酸顺序是随机的 4个bp为识别序列的 型酶来说，平均4 256） 为识别序列的Ⅱ 以4个bp为识别序列的Ⅱ型酶来说，平均44（256） 个核苷酸就有一个靶序列； 而对于以6个 为识 个核苷酸就有一个靶序列 ； 而对于以 个 bp为识 别序列的酶则平均4 别序列的酶则平均 6（4096）个核苷酸就有一个 ） 靶序列。 靶序列。
5 核酸的分子操作
5.1 限制性内切酶 5.2 操作和标记核酸的酶 5.3 分子杂交
工具酶的种类
核酸酶：用于切割或降解核酸分子。 ① 核酸酶：用于切割或降解核酸分子。 连接酶：用于把核酸分子连接到一起。 ② 连接酶：用于把核酸分子连接到一起。 聚合酶：用于核酸分子的扩增和拷贝。 ③ 聚合酶：用于核酸分子的扩增和拷贝。 修饰酶： ④ 修饰酶：用于给核酸分子添上或减去某些 化学基团或核苷酸。 化学基团或核苷酸。