创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路

摘要 背景：创伤后深静脉血栓形成的分子机制复杂，黏着斑激酶信号通路在深静脉血栓形成过程中的作用尚未阐明。 目的：探讨黏着斑激酶信号通路在创伤性深静脉血栓形成中的作用。 方法：取 20 只 SD 大鼠制备股骨骨折模型。造模后 5 d，根据血栓形成情况将模型大鼠分为 2 组：血栓形成组和无血栓形成 组，每组 10 只。另取 10 只正常大鼠作为对照组。无创切取大鼠股静脉血管组织，抽取总 RNA，Genechip Rat Genome 430 2.0 芯片测定股静脉 RNA 的表达，并分析黏着斑激酶信号通路基因表达的变化。 结果与结论：与无血栓形成组比较，血栓形成组中黏着斑激酶信号通路细胞外基质、蛋白激酶 C、Fyn、辅肌动蛋白、Vav 等关键基因均上调；下调的有整联蛋白 α、肌球蛋白轻链磷酸酶、c-Jun 基因。结果提示黏着斑激酶信号通路可能是调控血 栓生物学状态的重要信号通路。 关键词：创伤；深静脉血栓形成；黏着斑激酶信号通路；基因芯片
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P.O. Box 1200, Shenyang 110004
莫建文，等. 创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路

试剂和仪器：
试剂及仪器
来源
彩色病理图像分析仪 总 RNA 抽提试剂盒 基因芯片，扫描仪，芯片
分析软件
日本 OLYMPUS 公司 美国 invitrogen 公司 美国 Affymetrix, West
Mo JW, Hu HL, Bai B, Li Y, Zhang SJ, Chen Y, Deng JJ. Influence of focal adhesion kinase signaling pathway on formation of traumatic deep vein thrombosis.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(15): 2790-2793. [ ]
Sacramento 公司
方法： 动物模型的建立及分组：从30只SD大鼠中随 机取20只，参照文献的方法进行造模[12]。实验 大鼠不麻醉，采用定量打击装置进行定点打击， 瞬间打击能量为5 J。大鼠俯卧位，击打大鼠双 侧后肢大腿近端外侧各1次(大转子至大转子下 1 cm)造成股骨骨折后，均行髋人字石膏固定。 造模后5 d，取材进行镜下观察，根据血栓形成 情况将模型大鼠分为2组：血栓形成组和无血栓 形成组，每组10只。另外10只大鼠不造模，正 常饲养作为对照组。 取材：造模后5 d，大鼠麻醉后，无菌条件 下沿双侧大腿股静脉走行切开皮肤约3 cm，暴 露双侧股静脉及主要属支，无创分离动静脉， 切取长约3 cm的股静脉及主要属支，有血栓形 成的血管去除血管内的血栓，并用生理盐水冲 洗干净管壁及管腔内的血液，迅速放入冻存管， 置入液氮罐保存。 基因表达谱芯片检测：Trizol一步法提取上述 3组股静脉标本总RNA，并进行纯化和质检。 以各组总RNA为模板合成双链cDNA；体外转 录生成生物素标记的cRNA；纯化和片段化处 理 后 ， 取 10 µg cRNA 与 Genechip Rat Genome 430 2.0芯片进行杂交、洗脱、染色 扫描检测信号。 芯片图像的采集与数据分析：采用Affymetrix 扫描仪进行扫描，采用芯片分析软件(5.0版)进 行分析。差异表达基因的判断标准为：change 为 I ， Ratio≥1 ， 血 栓 形 成 组 和 无 血 栓 形 成 组 Detection 为 P 的 为 上 调 基 因 ； change 为 D ， Ratio≤ -1，对照组Detection为P的为下调基因。 pathway 查 询 分 析 ： 通 过 kegg pathway database(www.genome.jp/kegg/) 查 询 差 异 基 因参与的pathway信号传导通路。 主要观察指标：FAK信号通路基因表达的 变化。
黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK) 是一种非受体型的酪氨酸激酶，主要参与整合 素介导的信号传导，在细胞迁移、分化等多方 面具有重要影响[7-11]。FAK信号通路在创伤性 深静脉血栓形成过程中的作用机制尚未明了。
实验旨在探讨该通路对血栓形成的影响，以 期进一步了解创伤性深静脉血栓的发病机 制。
Mo Jian-wen1, Hu Hai-lan2, Bai Bo1, Li Ying1, Zhang Shu-jiang1, Chen Yi1, Deng Jin-jing1
1Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China; 2Department of Orthopaedics, the Second Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China
28 S 18 S
A BC A: control group; B: thrombosis group; C: no thrombosis group Figure 1 Total RNA electrophoretogram of 3
groups specimens 图 1 总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳图
0 引言
创伤性深静脉血栓是指由于创伤/手术等因 素引起的静脉栓塞性疾病，具有极大的潜在危 害性，如栓子脱落可引发致命性肺栓塞、脑梗 死及深静脉瓣膜功能不全等[1-6]，该疾患被公认 为创伤/术后严重的并发症之一。静脉血栓形成 是三大血栓性疾病(心肌梗死、缺血性卒中及静 脉血栓)之一，是多因素致病的疾病，多发生于 严重创伤及骨科大手术后的患者。
1 材料和方法
设计：随机对照动物实验。 时间及地点：于2008-10/2009-10在广州 呼吸疾病研究所实验室完成。 材料： 实验动物：健康SPF级SD大鼠30只，体质 量(250±20) g，雌雄不限。购于广东省医学实 验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2003-0002。 动物饲养于国家呼吸疾病研究所动物实验中 心，室温20~25 ℃，光线、通风良好，自由饮 水、进食。适应性喂养2周。
创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路*☆
莫建文1，胡海澜2，白 波1，李 颖1，张姝江1，陈 艺1，邓晋京1
Influence of focal adhesion kinase signaling pathway on formation of traumatic deep vein thrombosis
Mo Jian-wen☆, Doctor, Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China mjw1997@
doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.15.031
莫建文，胡海澜，白波，李颖，张姝江，陈艺，邓晋京.创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路[J].中国组织工程研
究与临床康复，2011，15(15):2790-2793.
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Supported by: the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 9151018201000035*
Received: 2010-11-25 Accepted: 2011-UND: The molecular mechanism of traumatic deep vein thrombosis is complex. The influence of focal adhesion kinase (FAK) signaling pathway on the development of deep vein thrombosis remains poorly understood. OBJECTIVE: To study the effects of FAK signaling pathway in traumatic deep vein thrombosis. METHODS: Twenty SD rats were prepared for femoral fracture models and divided into 2 groups according to thrombosis states, namely, the thrombosis and no thrombosis groups, with 10 animals in each group. Additional 10 rats served as controls. The femoral vein was incised and total RNA was extracted. The femoral vein RNA expression was detected by Genechip Rat genome 430 2.0 genechips, and the changes of FAK signaling pathway gene was analyzed. RESULTS AND CONCLUSION: Compared with no thrombosis group, the key genes of thrombosis group related to FAK signaling pathway of extracellular matrix, protein kinase C, Fyn, actinin and Vav were up-regulated, and integrinα, myosin light chain phosphatase and c-Jun were down-regulated. FAK signaling pathway may be one of the most important pathways to control the biological states of thrombus.
Correspondence to: Bai Bo, Professor, Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China drbobai@
造模后5d大鼠麻醉后无菌条件下沿双侧大腿股静脉走行切开皮肤约3cm暴露双侧股静脉及主要属支无创分离动静脉cm的股静脉及主要属支有血栓形成的血管去除血管内的血栓并用生理盐水冲洗干净管壁及管腔内的血液迅速放入冻存管置入液氮罐保存
中国组织工程研究与临床康复 第 15 卷 第 15 期 2011–04–09 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 9, 2011 Vol.15, No.15
2 结果
2.1 实验动物数量分析 实验共纳入SD大鼠
30只，均进入结果分析。 2.2 股静脉组织的总RNA提取及电泳图 各 组股静脉组织总RNA的A260/A280介于1.8~2.0 之间。琼脂糖凝胶电泳显示，28 S RNA和18 S RNA条带整齐，28 S与18 S的吸光度值之比约 为2，说明制备的总RNA样品完整性好、质量 高、无降解，见图1