细胞总RNA提取及逆转录ppt课件

逆转录酶：
• RT
存在于逆转录病毒 体内。 常见有哺乳动 物型37oC，禽类型 42oC 。
以mRNA为模板的 DNA聚合酶，构成与 RNA碱基相互补DNA
mRNA
AAAAAA(n)
10min 68-70oC, annealing mRNA
mRNA cDNA
1-2h
AAAAAA(n) 3 -TTTTTT(18)-5 37-42oC, RTase
❖留意： RNA沉淀的溶解一定要耐心 充分，一定要用加样器反复多次吹打方 可。但由于溶液体积非常小，要防止出 现气泡影响RNA的溶解。
防止气泡的方法： 用加样器的第一挡 每次吹打都不要打出气体
判别溶解程度：
吹打时液体流动不拐弯 为止。
14) 吸出 4.5 l溶液放到冰上备用 (将用于电泳)。
•第二步：逆转录反响
最常用的RNase抑制剂: 与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白量
变性。
有效浓度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。
用于浸泡各种器材。
灭活条件：高压。
在Tris溶液中半衰期为1.25min。
试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制, 高压)
储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。
留意: 电泳槽的清洁！ 一切试剂、器材、溶液需求灭RNA酶处置。 琼脂糖凝胶要新颖配制！ 紫外透射仪察看电泳结果
第二步：向上述反响溶液中依次参与以下试剂：
5RT-buffer
RNasin (40U/ml) dNTPs (10mmol/L) AMV
4 l 1 l 4 l 1 l
轻弹管底混合，置42℃水浴1h。
2、肝素： 运用浓度：0.1—10mg/ml 效 果: 37 C 时，可抑制95%的RNase 活力。
假设与DEPC结合运用， 具有极强的抑制 效果。
三、RNA提取的实验操作
5)参与200 l氯仿， 震荡混匀20-30s， 室温放置5min〔此期间液体开场分层，
此时不要随便搅动液体〕。
６)10000 rpm，离心5min。
A. 操作环境空气干净。带手套、口罩。 B. 用新开封的化学试剂。〔试剂应该公用〕 C. 一次性塑料器材最好是新开封，
(DEPC水处置后〕高压灭菌。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处置。
对玻璃器材还应该进展高温烘烤。
2、抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。
RNA分别的关键要素：防止RNA酶的污染。
二、离心机的运用及本卷须知
1、翻开电源
2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。
3、将样品标志好并配平, 对称放入离心机〔管 的衔接处朝外〕。
4、设定离心的转速和时 间。
5、一致离心。
Team Work
1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。
实验一、 细胞总RNA的提取及逆 转录
Protein
RNA (清澈透明)
DNA
7) 将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。
8) 沉淀RNA： 参与0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。 10000rpm，离心10min。弃上清。
９) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。 (留意贴管壁在沉淀的对侧缓慢参与，不要搅动沉淀)
10) 7500rpm离心1min，弃上清。 再离心几秒钟，将管壁液体〔用加样器〕完全移净。
特点：需低温操作，但价钱经济。
2、Trizol 试剂〔商品化产品〕 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。
3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚
dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分别出
RNase抑制剂引见
1、DEPC ( 二乙基焦炭酸盐)
将上述反响移至68℃水浴10min〔混灭匀活后，R可T用as离e心〕机，甩一下 并冰浴，保管备用。
RNA电泳
根本过程同DNA电泳一样，但：
1. 必需用对RNA酶有抑制造用DEPC水来配置一切 溶液，一切与RNA接触的仪器和安装都要严厉处置以尽 量减少RNA酶对样品的降解；
2. 由于RNA分子有二、三级构造可以影响其电泳结 果，因此电泳时应在变性剂存在下进展变性电泳以翻开 其空间构造，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。
(2) 顺时针调理--- 读数变小 逆时针调理--- 读数变大
(3) 留意：调理前，加样器读数正处于最大量程或最 小量程时，假设向错误方向调理，马上会超出量 程，将会损害加样器的精度。
练习：加样器读数为 100，实践体积各为多少?
5、加样器运用步骤：
1〕选择加样器,察看读数,调理读数。 安装吸头要严密(不要用手直接拿吸头)，安装后旋转固定一下。
RNA沉淀必需绝对枯燥，微量乙醇残留， 容易呵斥RT的失败，但过分枯燥又是呵斥 RNA不溶解的主要缘由 。
判别RNA沉淀能否充分枯燥但又不是过 分枯燥是逆转录胜利的关键环节。
RNA pellet：透明胶样 枯燥后应该无色透明
13〕 RNA的溶解：用加样器汲取冰冷DEPC-H2O 13.5 l，加 到RNA上，反复吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保管。
2〕在液面外，先按到第一挡。
3〕将吸头插入液面第下的一适挡当为深实度践: 读数体积， 第过深二能挡够为会协腐助蚀彻加样底器打,出过液浅体能，够会防吸止入吸空头气内。液体残留。
4〕缓慢松开拇指,汲取液体。 完全放开拇指后，停留半秒钟。急于分开液面，易吸入空气。
5〕抬起加样器,估计体积能否正确,将外壁液体用容器口引流回去 6〕贴容器内壁，加样器推到第二挡将液体匀速打出。(吸头内有液 体时，不能将加样器平放或倒置，液领会倒流损坏加样器！)
用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进展。 当RNA沉淀用水溶解后，应该留意在冰上操作，操作要迅速。
12)室温枯燥3－5min。 〔枯燥的时间由RNA沉淀大小决议〕 〔枯燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，沉淀要充
分枯燥但防止过分枯燥，此步骤非常关键〕
本卷须知：
RNA:
防止放在37 C孵箱中过度枯燥以防无 法溶解。
三、RNA提取的实验操作
1) 发放口罩、帽子、手套，每个组来一个人领取。 将1mL Trizol试剂移入Eppendorf管中。
2) 实验教师操作: 取新颖小鼠肝脏组织，组织块不 宜过大,放在玻片上立刻研磨,研磨要彻底。
3) 将 研 磨 后 的 组 织 ( 小 米 粒 大 小 ) 转 移 至 1mL 的
分子生物学实验
～欢迎大家参与分生实验课的学习！
1、 每组同窗做一份实验； 2、 遵守实验室规那么，穿白衣； 3、 同窗们在听课时要作好记录; 4、 上课时间。
2019年 五年制 实验课考试方式
1. 实验成果考核占总成果15%。 2. 每次实验报告5分含随堂测试，共三次，合15分。 3. 缺实验课成果者，本课程不予经过。
RNA电泳结果
rRNA可以作为内部 Marker分子，经过察看 rRNA的两条带〔28S和18S〕 的比例，可以判别所提取 mRNA能否存在降解。
RNA电泳并不能判别 mRNA能否提取胜利，也不 作为鉴定RNA提取质量的常 规方法，由于在电泳过程中 RNA能够发生降解。
RNA电泳结果分析
分析本次实验结果：28S、 18S和5S的比例。
退火后一定迅速放在冰上
实验报告思索题：
1.提取细胞内RNA时，如何防止RNA酶的 污染？
2.如何分析RNA变性电泳的结果，可以据 此准确判别RNA能否降解吗？为什么？
实验终了后： 整理实验台； 交实验报告； 值日生值日。
关键点：
RNA能否充分溶解
根据组织或细胞的量确定逆转录反 响的体积，通常利用1ml Trizol试 剂提取出来的总RNA适宜于20l体 积的逆转录反响体系。
引物的量能否适宜
RT引物的用量非常 少，由于模板量是固 定的，而且只进展一 次反响。
高温退火防止Oligo dT锚锭点错误， 同时，翻开RNA链之间的二级构造， 利于RT。
Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2min以
上
。
使组织细胞充分裂解。肉眼察看可见液体变成均
匀浑浊状。
4)室温孵育10 min。
课间引见 RNA提取的几种方法
1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白量变性剂，裂解细胞的同
时，还能有效地抑制内源性 RNase的活性，经过有 机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。
【每名同窗的3个实验报告放在一同，最后一次实验课交。 学生交卷后签名。教师按学号排卷。】
先引见本轮实验中两种 常用仪器的运用方法
1. 加样器
2. 离心机
一、加样器的运用及本卷须知
1、 用途 —— 微量汲取液体 2、 每组3支加样器
顶部标志加样器的最大量程，分别为：
20 l:
0.5 ~ 20 l
100 l: 20 ~ 100 l
AAAAAA(n) 3 -TTTTTT(18)-5
按照以下方法进展RT反响：
第一步： 翻开RNA链之间的二级构造， 使Oligo dT 特异性地结合到 PolyA 尾。来自总RNA9 l
Oligo dT (0.05g/ml) 1 l (终浓度：2.5 ng/ml)
轻弹管底混合， 置65℃水浴10min， 然后立刻冰浴2min〔防止RNA构成二级构造〕。
在水浴10分钟时，开场RNA电泳。
•第三步：RNA 的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
RNA的变性〔甲醛变性法〕：
翻开RNA分子二级构造，其分子量和电泳间隔相关。
5×甲醛变性缓冲液 甲酰胺
37%甲醛 RNA样品 上样缓冲液
2 l 10 l 2l 4.5 l
3l
混匀后， 21.5 l 直接电泳上样〔100伏，10－30分钟〕 上样前可先预电泳5min。
实验内容： 1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 2、RNA的变性琼脂糖凝胶电泳 3、以总RNA为模板的逆转录反响
•第一步： 提取小鼠肝脏组织的RNA
一、真核细胞的总RNA
1、mRNA: 1-5% 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1〕免受核酸酶破坏， 2〕起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴构造 20--200个A. 翻译所必需。 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。
1000 l: 200 ~ 1000 l
3、 根据取样量，选择适宜量程的加样器。
Q：假设要汲取5μl、50μl、150μl、 500μl 的液体，应选择哪个加样器?
4、如何调理？
(1)首先察看目前的读数,假设为050: 最大量程为20l的加样器 — 5l 最大量程为100l的加样器 — 50l 最大量程为1000l的加样器 — 500l
2、tRNA: 10-15%
3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt
二、RNA提取的本卷须知
RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材外表。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。
1、 尽量防止外源性RNase 污染