人外周血淋巴细胞分离、计数、活力测定临床免疫学实验报告

实验温度：18℃湿度：32% 实验时间：2012年11月8日实验八、人外周血淋巴细胞分离、计数、活力测定
【实验目的】
1.通过该实验掌握外周血淋巴细胞分离、计数的方法。

2.有助于观察机体免疫状态。

【实验原理】
人外周血RBC、粒细胞比重为：1.092，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，比重为1.075，因此选用一种比重介于二者之间而近于等渗的淋巴细胞分离液（比重为1.077±0.001）进行密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布，从而分离出单个核细胞（淋巴细胞）。

【实验材料】
1．肝素溶液用生理盐水将肝素配成125～250 U/ml的溶液，置4℃下保存备用。

2．淋巴细胞分层液市售或自配，20℃时密度应为(1.077±0.001)g/L。

3．Hanks液pH 7.2～7.4。

4．完全RPMI-1640培养液。

5．15 ml或50 ml锥底离心管。

6．水平离心机，显微镜。

7．玻璃吸管，滴管，细胞计数板等。

8．2％台盼蓝染液。

【实验步骤】
1.采集静脉血3ml，注入盛有肝素的无菌小瓶中（每ml全血加0.1 ml 肝素溶液），立即轻轻摇匀，使血液抗凝。

2.用吸管加入等量Hanks液，使血液等倍稀释。

3.吸取淋巴细胞分离液2ml置于离心管中，然后将上述稀释血液在距分离液界面上1cm处沿试管壁缓慢叠加至分离液表面。

应注意保持两界面清晰，勿使血液混入分层液内。

4.将离心管置水平式离心机内，在18～20℃下，以2000 r/min离心20min，离心后，管内分层如下图所示
5.用毛细吸管轻轻插入灰白细胞层，沿管壁轻轻吸出该层单个核细胞，转入另一支离心管中。

6.将所得到的单个核细胞悬液用5倍体积的HanK’s洗涤2次，每次以1500 r/min 离心10 min，弃上清。

7.混悬细胞，沉淀加1640培养液1ml，摇匀。

8.计数细胞：取0.1ml细胞悬液，加WBC稀释液0.9ml，混匀，静止片刻，冲池，低倍镜下计数四大格细胞总数。

9.台盼蓝染液测活性，取2滴混悬细胞液于玻片，加2％台盼蓝染液1滴，混匀，铺开，高倍镜镜检。

3 min内数完100个细胞，计数活细胞百分率：台盼蓝染液检查活细胞不着色（无色），死细胞染成蓝色。

【实验结果】
1.淋巴细胞计数：正常≥1×106/ml，青年人≥2×106/ml。

实际细胞数=（61+52+60+53）/4×105=5.65×106./ml＞2×106/ml。

2.淋巴细胞活力测定：台盼蓝染液检查活细胞不着色（无色），死细胞染成蓝色。

计数100个细胞，计算活细胞百分率，一般活性≥95％。

淋巴细胞活力=98/100×100%=98%＞95%。

【实验讨论】
1.与血液样品接触时应注意安全防护，避免血源性传染病传染。

2.操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。

3.细胞分层液在室温下应为(l.077±0.001) g/L；应避光4℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用。

使用中应避免细菌污染。

4.稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时，则不能稀释血液，以免影响血浆成分。

5.测定的临床意义：了解机体的免疫状态。