TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程

TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程
HEREDITAS (Beijing)2013年4⽉,35(4):533―544ISSN /doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html
实验指南
收稿⽇期:2012?12?30;修回⽇期:2013?02?05
基⾦项⽬:国家重⼤科学研究计划项⽬(编号：2012CB945101和2011CBA01000)和国家⾃然科学基⾦项⽬(编号：31110103904)资助作者简介:沈延,博⼠,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。

Tel ：010-********;E-
mail:yshen@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 通讯作者:张博,博⼠,教授,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。

E-mail:bzhang@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 致
谢:感谢祖尧为改进检测技术做出的贡献。

⽹络出版时间:2013-3-515:03:12
URL:/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html /kcms/detail/11.1913.R.20130305.1503.002.html
DOI:10.3724/SP.J.1005.2013.00533
TALEN 构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程
沈延,黄鹏,张博
北京⼤学⽣命科学学院,细胞增殖与分化教育部重点实验室,北京100871
摘要:类转录激活因⼦效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的⼀
类新型的⼈⼯核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA 结合结构域和⾮特异性的Fok Ⅰ核酸内切酶切割结构域组成。

TALEN 能够根据⽤户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA 双链断裂,从⽽诱导该靶序列产⽣indel 突变,⽬前已成功地应⽤于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。

⽂章介绍TALEN 靶点的选择与确认,采⽤“单元组装法”构建⼈⼯TALEN 的原理与步骤,以及通过显微注射TALEN mRNA 诱导并筛选斑马鱼突变体的实验流程与经验。

这些⽅法理论上也适⽤于对其他物种进⾏基因打靶。

关键词:类转录激活因⼦效应物核酸酶(TALEN);斑马鱼;基因组定点突变;基因打靶;反向遗传学技术
A protocol for TALEN construction and gene targeting in zebrafish
SHEN Yan,HUANG Peng,ZHANG Bo
Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education ,College of Life Sciences ,Peking University ,Beijing 100871,China
Abstract:TALEN (Transcription activator-like effector nuclease)is a newly developed family of artificially engineered sequence-specific endonucleases,which consists of a highly specific and repetitive DNA-binding domain derived from TALE (Transcription activator-like effector)and fused with the non-specific endonuclease domain of Fok Ⅰ.TALENs have been reported to be able to induce site specific genome modification in quite a few species and in vitro cultured cells.Here,we introduced the principles for target site selection and confirmation and described a brief experimental protocol for the easy construction of customized TALENs using unit assembly (UA)method and also for generation of and screening for TALEN-mediated targeted zebrafish mutants through microinjection of TALEN mRNAs into zebrafish embryos.Theoretically,the principles and methods we described here are also applicable to gene targeting in other species.
Keywords:transcription activator-like effector nuclease (TALEN);zebrafish;site specific genome modification;
gene targeting;reverse genetics approach
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HEREDITAS(Beijing)2013第35卷进⼊21世纪以来,斑马鱼(Danio rerio)由于胚
胎透明、发育快、后代数量⼤等种种优势逐渐成为遗传发育研究领域中⼀种重要的模式⽣物[1~4]。

然⽽,由于斑马鱼的胚胎⼲细胞(ES)技术不够成熟,因此还⽆法像⼩⿏那样通过ES途径进⾏基因打靶。

最近⼗⼏年来,⼈们始终在不遗余⼒地尝试通过各种途径在斑马鱼中制备/筛选突变体,并且已陆续建⽴了多种⽅法,例如,ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)化学诱变、TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)、反转录病毒插⼊诱变、基因诱捕(Gene trap)和ZFN(Zinc finger nuclease)介导的定点突变等[5,6]。

但是这些⽅法都有各⾃的局限性,还没有⼀种能够实现对斑马鱼的任意基因进⾏靶向修饰。

直到2009年,有两组科研⼈员同时揭⽰了来⾃植物病原菌——黄单胞杆菌(Xanthomonas spp.)中TALE (Transcription activator-like effector)家族的蛋⽩结构单元与DNA靶序列之间存在⼀⼀对应的特异性识别并结合的秘密[7,8],基因组定点突变技术才打开了新的局⾯。

迄今仅短短3年的时间,⼈们已经利⽤TALE蛋⽩这种特殊的DNA结合结构域跟FokⅠ核酸酶结构域融合构成⼈⼯TALE核酸酶(TALE nuclease,简称TALEN),建⽴了理论上能够对任意物种进⾏基因打靶的新技术,并且成功地在体外培养的⼈类细胞、线⾍、斑马鱼、⼤⿏、果蝇等17个物种中实现了基因组定点突变(详见本期另⽂发表的综述“类转录激活因⼦效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术”[9])。

由于斑马鱼的反向遗传学技术相对于果蝇、线⾍等经典模式动物⽽⾔更亟待完善,因此,TALEN技术的建⽴对于斑马鱼研究领域更有着不同寻常的意义[10,11]。

TALEN技术应⽤的关键步骤之⼀是TALEN表达载体的构建。

天然TALE蛋⽩DNA结合结构域的核⼼部分⼀般由1.5~33.5个基本重复单元(Repeat unit)串联⽽成,其中每个单元包含34个左右的氨基酸残基[12]。

每个重复单元中第12位和13位的氨基酸残基称为重复可变双残基(Repeat variable di-residue,简称RVD),它决定了该单元识别DNA碱基的特异性。

常⽤的RVD包括NI(Asn Ile)、HD(His Asp)、NG(Asn Gly)和NN(Asn Asn),分别对应识别碱基A、C、T和G[7,8]。

⽬前⼈们已报道了多种⽅法⽤于构建TALE串联重复序列(TALE repeats),其中“单元组装法”(Unit Assembly,UA)是本实验室建⽴的⼀种简便、可靠的构建TALE串联重复序列的⽅法。

该⽅法的起始材料只需要分别对应于识别4个碱基的4个TALE基本单元模块,采⽤3个常见的限制性内切酶SpeⅠ、NheⅠ和Hin dⅢ,通过简单的酶切—连接反应,即可像搭建积⽊那样串联组装出任意长度、任意顺序的TALE重复序列[10]。

本⽅法最⼤的优势在于原理简单、可操作性强,不需要任何特殊的试剂或仪器,只要掌握了常规的分⼦克隆操作技术,就可以⽤本⽅法组装出⽤户指定的TALE串联重复序列。

下⾯详细介绍本实验室采⽤单元组装法构建⼈⼯TALEN表达载体并在斑马鱼中进⾏基因组定点突变的具体实验流程与经验。

需要指出的是,⽤本⽅法构建的TALEN同样可以⽤于⾼效、定点突变其他物种或细胞的基因组[13]。

1材料
1.1实验材料
感受态细菌：⽤于构建TALEN表达载体。

性成熟的斑马鱼：⽤于突变斑马鱼内源基因。

建议选⽤实验室常⽤的近交系品种[14]。

1.2质粒与试剂
1.2.1构建TALEN所需的质粒与引物
TALE单体质粒系列(TALE基本单元模块载体[10]) (图1)：均为氨苄青霉素(Amp)抗性。

共4种,分别称为pA(NI)、pC(HD)、
pG(NN)和pT(NG)。

由本实验室在pMD18-T(TaKaRa)载体⾻架的基础上构建,作为组装
TALE串联重复序列的起始载体。

TALE单体在连⼊pMD18-T载体时⽅向可正可反,并不影响
图1TALE基本单元模块载体结构⽰意图
以pC、pG和pT为例,pA的插⼊⽅向与此相反。

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TALE重复序列的构建。

在我们⽬前所⽤的4种载体中,pC、pG和pT都是从M13-47到RV-M的⽅向连⼊,⽽pA则是从RV-M到
M13-47的⽅向插⼊。

这类质粒的代表性序列详见补充材料。

pCS2-0.5TALE-FokⅠ表达载体系列(简称pCS2-FokⅠ表达载体[10])(图2)：均为氨苄青霉素(Amp)抗性。

需成对使⽤(pCS2-PEAS系列和pCS2-PERR系列配对)。

由本实验室在pCS2载体的基础上构建。

可作为⾻架载体,⽤于插⼊组装好的TALE串联重复序列,以便最终构建出TALEN表达载体。

该系列载体除了含有FokⅠ切割结构域的编码序列之外,还带有CMV启动⼦/增强⼦、SP6启动⼦、来⾃SV40的核定位序列(NLS)、3×FLAG标签(pCS2-0.5TALE-PEAS系列载体)或HA标签(pCS2-0.5TALE-PERR系列载体)等功能元件。

此外,该载体中还预先组装了TALE重复结构域中3′端的最后0.5个重复单元(识别TALEN靶点中的最后⼀位碱基),因此,该系列载体包括分别识别A、C、T、G等4种末位碱基的4对(共8种)载体(表1)。

这类质粒的代表性序列详见补充材料。

构建和检测TALEN载体所需的引物见表2。

1.2.2构建TALEN以及在斑马鱼中检测TALEN活
性所需的试剂与溶液
NEB限制性内切酶：Hin dⅢ-HF、KpnⅠ、NheⅠ-HF、NotⅠ-HF或SacⅡ、SpeⅠ-HF。

试剂盒：DNA连接试剂盒(TaKaRa,D6020)、微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(康为世纪,CW0524)、质粒⼩提试剂盒(康为世纪,CW0511)、快速DNA产物纯化试剂盒(康为世纪,CW2301)、SP6mMESSAGE mMACHINE Kit(Ambion,AM1340)(⽤于体外转录TALEN mRNA)、T载体试剂盒(pMD?18-T,TaKaRa, D101A)
琼脂糖、DNA marker、1×TAE、氨苄青霉素、LB琼脂培养基、LB液体培养基、2×Taq MasterMix (含染料)(康为世
纪,CW0682)、碱性磷酸酶
(CIAP,
图2pCS2-FokⅠ表达载体结构⽰意图
表1pCS2-FokⅠ表达载体列表
pCS2-0.5TALE-FokⅠ系列(简称pCS2-FokⅠ系列)pCS2-0.5TALE-PEAS系列
(简称pCS2-PEAS系列)
pCS2-0.5TALE-PERR系列
(简称pCS2-PERR系列)
pCS2-A-FokⅠ系列pCS2-A-PEAS pCS2-A-PERR
pCS2-C-FokⅠ系列pCS2-C-PEAS pCS2-C-PERR
pCS2-T-FokⅠ系列pCS2-T-PEAS pCS2-T-PERR
pCS2-G-FokⅠ系列pCS2-G-PEAS pCS2-G-PERR
表2构建和检测TALEN载体所需引物列表
名称序列(5′→3′)⽤途
M13-47CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC检测TALE重复序列单元数和序列的引物之⼀RV-M AGCGGATAACAATTTCACACAGGA检测TALE重复序列单元数和序列的引物之⼀A-For TAGCGATTGCTAGTAATATT检测TALE重复序列连接⽅向的上游引物
C-For TAGCGATTGCTAGTCATGAC检测TALE重复序列连接⽅向的上游引物
G(NN)-For TAGCGATTGCTAGTAACAAT检测TALE重复序列连接⽅向的上游引物T-For TAGCGATTGCTAGTAATGGG检测TALE重复序列连接⽅向的上游引物
63dn CGGCAACGCGATGGGATGTG检测TALE重复序列连接⽅向的下游引物
SP6ATTTAGGTGACACTATAG检测TALE重复序列连接⽅向的测序引物
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TaKaRa,D2250)、1mol/L Tris(pH8.0)、50mmol/L NaOH、70%⼄醇、超纯⽔(ddH2O,18M?)
1.3仪器与耗材
1.3.1仪器
(1)构建TALEN所需仪器：超净⼯作台(细菌操作⽤)、细菌培养摇床、台式离⼼机、凝胶电泳仪、凝胶电泳槽、凝胶成像仪、⽔浴锅、恒温培养箱、漩涡振荡器(Vortex)、NanoDrop(ND-1000 Spectro pho tometer)、PCR仪
(2)在斑马鱼中检测TALEN活性所需的额外仪器：显微注射装置、体视显微镜、恒温培养箱、配鱼缸、台式冷冻离⼼机
1.3.2耗材
细菌培养⽫、移液器、移液器吸头、Eppendorf 离⼼管、PCR管、显微注射针。

2实验流程
2.1采⽤“单元组装法”构建TALEN表达载体与活
性检测的基本原理与过程
由于TALE重复序列的结构是串联重复、⾸尾相接的,因此,理论上可以将重复单位中的任意两个相邻的氨基酸残基作为串联重复序列的起点和终点进⾏结构组装,最后只需要把第⼀个重复单位和最后⼀个(或0.5个)重复单位的两端补齐,即可构成完整的TALE重复序列。

根据这⼀原理,我们选择TALE重复单位中第11位的丝氨酸残基(Ser,S)到下⼀个重复单位中第10位的丙氨酸残基(Ala,A)之间的序列作为新的重复单位(称为“替换单元”,图3A)进⾏TALE重复序列的构建。

这样,我们就可以利⽤氨基酸密码⼦的简并性,在“替换单元”的⼀端(N 端)设计⼀个SpeⅠ的酶切位点,另⼀端(C端)设计其同尾酶NheⅠ的酶切位点。

利⽤同尾酶可产⽣相同的粘性末端、但是连接在⼀起后⼜会丧失原有的酶切位点的特点,通过反复的酶切—连接反应,就可以将所需要的重复单元依次组装到⼀起(图3B)。

最后,将TALE重复序列跟FokⅠ切割结构域的编码序列整码(In-frame)连接,即可构建出完整的TALEN 编码序列及表达载体(图3C)。

更多关于构建、应⽤和检测TALEN的各种⽅法的信息可参考本期另⽂发表的综述“类转录激活因⼦效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术”[9]和由本验室建⽴的⼈⼯核酸内切酶(Engineered endonuclease,EEN)的综合数据库与知识库⽹站EENdb(/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html /)[15]。

2.2TALEN靶点选择与确认
2.2.1TALEN靶点的预测与选择
应⽤TALEN技术的⾸要步骤是选择并确认基因组的靶位点。

由于TALEN中的FokⅠ核酸酶结构域通常以⼆聚体的形式起作⽤,因此,TALEN结合位点(或称TALE结合位点)也需要成对选择。

这样,⼀个完整的TALEN靶位点(或简称靶点)就包含⼀个左侧TALE 结合位点及其0位的t碱基和⼀个右侧TALE结合位点及其0位的t碱基,以及它们之间的间隔序列(Spacer)。

其中,左、右两侧的TALEN单侧靶点(即TALEN结合位点)也可称为“半位点”(Half-site)。

除⾮有特别说明,本⽂下⾯提到的TALEN靶点均指由左、右两个TALE结合位点(半位点)及其两侧0位的t碱基加上中间的Spacer所构成的完整的靶序列(图4)。

TALE/TALEN单侧靶点(即半位点)及其0位的t 碱基的结构通式为：5′-t(N)n N-3′。

应⽤本⽅法构建TALEN表达载体建议遵从如下原则选择靶点(图4)：
(1)半位点的⽅向：TALE蛋⽩⾃N端到C端识别并结合DNA单链的⽅向是从5′端到3′端(图4)。

为了便于FokⅠ结构域形成⼆聚体,TALEN靶点中左、右两侧半位点的单链⽅向必须是相反的,即⼀个半位点设计在正义链上,另⼀个半位点则需设计在反义链上。

(2)半位点的长度：单侧靶点(半位点)最好控制在11~16bp(即n=11~16;这⾥并不包括0位的t),这样即能保证靶向的特异性,也不需要太多的构建步骤。

合成识别⼤于16bp靶点的TALE重复序列和相应的TALEN需要增加酶切—连接的步骤,花费额外的时间和精⼒;如确有必要也可以选择。

(3)0位碱基(需要特别指出的是,这个0位的t 并不需要组装对应的TALE单元模块)：紧邻单侧靶点(半位点)5′端上游的第⼀个碱基(称为第0位的碱基)必须为t(图3、图4)[7,16]。

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图3“单元组装法”构建TALEN表达载体的基本原理与过程⽰意图
(4)末位碱基：单侧靶点3′端的最后⼀个碱基(对应于TALE中的最后0.5个重复单位)尽量选择T(因为天然存在的TALE家族蛋⽩的靶序列中末位为T 的占⼤多数)(图4)。

(5)Spacer的选择：本⽅法采⽤的TALE重复序列与FokⅠ切割结构域之间相连接的氨基酸残基数为63,因此,Spacer的碱基数最好控制在12~21bp。

同时,如果计划⽤酶切的⽅法检测TALEN的活性与效率,还需要在Spacer中找到⼀个单⼀的限制性内切酶位点,并且尽量让这个酶切位点位于Spacer的中间位置。

(6)靶点预测⼯具：可以通过Bogdanove实验室
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图4TALEN对及完整靶点结构⽰意图
提供的TALEN靶点预测⽹站(https://tale-nt.cac. /doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html /)进⾏靶点预测,也可以先通过NEB公司的⽹站(/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html /NEBcutter2/index.php)找到酶切位点,再在酶切位点的两侧⼈⼯寻找TALE 结合位点。

选择TALEN靶点时需要考虑的其他问题可参考本⽂后⾯的“3常见问题和注意事项”。

2.2.2TALEN靶点的序列确认、酶切位点确认,以
及实验材料的遴选
由于TALEN的序列特异性较⾼,靶序列中只要有⼀个碱基出现错配(Mismatch)就有可能较⼤幅度地降低TALEN的活性。

因此,选定靶点后,强烈建议实测⼀下每个实验室⾃⼰养殖的实验材料(例如斑马鱼、果蝇等动植物个体或体外培养细胞)的实际序列,根据实测序列调整靶点的序列,并且最好⽤同⼀批(测序确认正确,并且靶序列是纯合的)实验材料进⾏TALEN打靶实验,以避免SNP 的影响。

(1)确认靶点在基因组中的唯⼀性：在Ensembl ⽹站上分别⽤单侧靶点序列进⾏Blast⽐对,确认该序列在所选⽤的物种的基因组中是单⼀位点。

否则建议重新选择靶点。

(2)PCR扩增靶点序列：从准备打靶的实验材料中PCR扩增靶点及附近的序列。

引物距离靶点最好⼤于100bp,PCR产物最好不要超过500bp,并且扩增后为单⼀条带。

(3)测序确认靶点序列：PCR产物直接送去测序(不要经过TA克隆),根据实测序列调整或重新选择靶点。

注意应选择测序结果显⽰为单⼀序列的实验材料(动植物个体或细胞株)确认靶点,不要选择含有SNP或其他变异的杂合⼦。

(4)检测酶切位点的效率：如果计划采⽤酶切的⽅法检测TALEN活性,则需要对上述PCR产物进⾏酶切验证。

要求尽量酶切完全,并且电泳后能明显与原条带区分开。

(5)遴选实验材料：根据后续打靶实验的需要,采⽤上述的PCR与测序策略筛选出⾜够量的靶点正确且为纯合的实验材料(动植物个体或细胞株)。

2.3构建TALEN表达载体
2.3.1⽤“单元组装法”构建TALE重复序列
(1)设计TALE重复序列的具体构建⽅案：
按⽰例的格式填写经前述步骤确认过的TALEN 靶点信息,并设计构建⽅案。

【⽰例1】斑马鱼tnikb基因TALEN靶点信息
基因名左半位点长度(bp)Spacer长度(bp)Spacer中的内切酶右半位点长度(bp)
tnikb
15
(⼤写字母,带下划线)15
Bam HⅠ(ggatcc)
16
(⼤写字母,带下划线)
5′-t GTTATTTTCTCCCC T aa ggatcc tgcgggc A TTTTTGAGCTGGTGG a-3′3′-a CAATAAAAGAGGGG A tt cctagg acgcccg T AAAAACTCGACCACC t-5′
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【⽰例2】斑马鱼tnikb左侧半位点(下划线所⽰序列)及构建⽅案
5′-(t)GTTATTTTCTCCCC(T)-3′
轮数G T T A T T T T C T C C C C 1GT TA TT TT CT CC CC 2GTTA TTTT CTCC CC 3GTTATTTT CTCCCC
4GTTATTTTCTCCCC
注意：斑马鱼tnikb左侧半位点长度为15bp(不包含0位的t),但是在这⼀步只需要构建识别其中14bp的TALE重复序列,⽽不需要构建对应于3′端最后⼀位碱基(T)的TALE重复单元。

详见【⽰例4】的说明。

(2)根据构建⽅案选择两个相邻的TALE重复载体,分别进⾏双酶切与电泳、切胶回收(⽰例3,图3B)。

⽤NheⅠ和Hin dⅢ双酶切处于TALE重复序列N端(对应识别5′端靶序列)的TALE质粒,回收得到TALE⾻架⽚段(N端TALE,包含TALE元件和载体⾻架;需回收的长度为2.7kb的⾻架+m×102bp 的TALE元件);⽤SpeⅠ和Hin dⅢ双酶切处于TALE 重复序列C端(对应识别3′端靶序列)的TALE 质粒,回收得到TALE元件⽚段(C端TALE,仅包含TALE 元件;需回收的长度为(m×102+16)bp的⽚段)。

此处,m代表载体中所含的TALE重复单元数。

【⽰例3】四单元载体GTTA的构建⽅案：
⽤NheⅠ和Hin dⅢ双酶切GT质粒,回收TALE⾻架⽚段(~2.9kb);⽤SpeⅠ和Hin dⅢ双酶切TA质粒,回收TALE元件⽚段(220bp)。

注意：①也可以采⽤其他的酶切组合构建同样的TALE重复载体。

例如,可以采⽤G+TTA的组合构建GTTA载体。

不过,TALE单载体经SpeⅠ和Hin dⅢ双酶切后得到的TALE单体⽚段只有100多bp,如果⼩⽚段DNA回收的得率不⾼,会影响到后续的连接。

因此,最好不要采⽤C端为单载体的组合(例如,最好不要采⽤GTT+A的组合)。

②剩余的胶回收产物可标注清楚后保存于?20℃,以便⽤于构建其他位点。

(3)连接、转化,涂氨苄青霉素平板(Amp抗性), 37℃培养12h。

(4)挑取单克隆菌落,液体培养基培养,⽤M13-47和RV-M引物对进⾏菌液PCR鉴定。

注意：PCR的延伸时间要根据载体中TALE重复单元的数⽬(m)进⾏调整(表3)：⼀个TALE单元有102bp,⽽引物还会在质粒⾻架上额外扩增168bp,这样,PCR产物的总长度就是(102×m+168)bp。

(5)电泳检测,将PCR鉴定正确(预期产物长度参见表3)的剩余菌液扩⼤培养,提取质粒,即完成了本轮组装,得到了本轮所需的TALE重复序列中间载体。

注意：经菌液PCR鉴定正确的质粒可以作为中间载体存放在?20℃冰箱,以备构建其他位点时使⽤。

(6)重复步骤(2)⾄(5),延长TALE串联重复序列,直⾄达到所需的顺序与数⽬(图5)。

所得到的载体称为pMD-TALE(图5)。

【⽰例4】从单载体开始,通过4轮酶切—连接构建tnikb左侧半位点TALE重复序列(图5)(除最后0.5个重复单元之外)的步骤：
注意：由于TALE中的最后0.5个重复单元已经预先构建到pCS2-FokI系列载体中,因此,每⼀个TALEN单侧靶位点中3′端的最后⼀个碱基(对应于最后0.5个重复单元)不在上述构建范围之内！例如,上例中的tnikb左侧半位点的序列应为15个碱基：5′-GTTATTTTATCCCC T-3′,在这⼀步骤中,只需要组装对应于前14个碱基5′-GTTAT TTTATCCCC-3′的TALE重复单元即可。

(7)TALE串联重复序列pMD-TALE构建完毕后,挑单克隆做PCR、电泳检测,选取⼤⼩正确的克隆送测序检验(⽤通⽤测序引物M13-47和RV-M双向测序)。

注意：由于TALE重复序列较长且重复性很强,需要选择⼀个技术较好、质量有保证的测序公司,才能保证将双向的TALE序列拼接完整。

表3TALE单元数与PCR产物长度和PCR延伸时间列表
TALE单元数(m)2345678910111213141516 PCR产物长度
(bp)37247457667878088298410861188129013921494159616981800延伸时间
25"30"40"50"50"1'1'1'10"1'20"1'20"1'30"1'30"1'40"2'2'
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图5tnikb左侧半位点TALE重复序列的构建过程⽰意图
2.3.2将TALE重复序列与FokⅠ相连,构建TALEN
终载体pCS2-TALEN(TALEN表达载体)
为了提⾼FokⅠ的酶切活性[17]、TALEN靶向的特异性,本⽅法采⽤了只能以异⼆聚体的形式起作⽤的两种Sharkey form的FokⅠ变体(PEAS和PERR)配对使⽤。

此外,pCS2-FokI载体的选⽤还同时取决于半位点中3′端的最后⼀个碱基。

(8)根据两个TALEN半位点最后⼀位碱基的性质选⽤合适的pCS2-PEAS和pCS2-PERR载体对,⽤NheⅠ分别单酶切,电泳、切胶回收(5.5kb)。

例如：对于tnikb的左侧半位点,由于其最后⼀位碱基为T,因此应选⽤pCS2-T-PEAS或pCS2-T-PERR。

(9)CIAP去磷酸化,快速DNA产物纯化试剂盒回收后备⽤。

(10)⽤SpeⅠ和NheⅠ双酶切“2.3.1”中第(7)步组装好的TALE重复序列载体pMD-TALE,电泳后切胶回收备⽤。

回收(n×102)bp⼤⼩的条带(n表⽰pMD-TALE载体中的TALE重复单元数),得到TALE重复序列⽚段。

(11)将上述去磷酸化的pCS2载体⾻架与双酶切后回收的TALE重复序列⽚段连接、转化,涂氨苄青霉素平板,37℃培养12h。

(12)菌液PCR鉴定TALE重复序列⽚段的连⼊⽅向：根据“2.3.1”中第(7)步组装出来的TALE重复序列中的最后⼀个完整重复单元(3′端)的性质选⽤上游引物(A-For、T-For、C-For或G(NN)-For)。

如果这个重复单元跟FokⅠ载体上预设的0.5个重复单元的RVD相同,则需要向前(5′端⽅向)寻找⼀个与该RVD不同的序列作为引物。

例如：对于tnikb 的左侧半位点,由于其最后⼀位碱基为T,⽽最后⼀个完整重复单元识别的是C,因此应选C-For作为上游引物。

下游引物63dn位于pCS2-FokⅠ的⾻架上。

不同位置的上游引物,PCR延伸的时间不同,PCR产物的长度也不同。

例如,上游引物对应最后⼀个完整的TALE单元时预期应扩增出
~350bp的条带;⽽每向5′端⽅向位移⼀个TALE重复单元,PCR产物就会增加102bp。

如果TALE重复序列连⼊的⽅向正确,就能扩增出条带,否则⽆法扩增出条带。

可据此鉴定连⼊⽅向正确的菌落。

同时⽤SP6通⽤引物测序确认。

(13)酶切检测TALE重复序列⽚段的连⼊情况：利⽤pCS2-TALEN载体上的KpnⅠ和NheⅠ两个酶切位点对pCS2-TALEN载体进⾏双酶切鉴定,可以检测在上⼀步的酶切—连接反应中是否发⽣了TALE重复序列的串连或断连,同时也可以⽤来鉴定TALE重复序列连⼊pCS2-FokⅠ载体的⽅向(图6)。

pCS2-TALEN质粒⾻架⼤⼩约为5kb,TALE重复序列的⼤⼩为(n×102+443)bp。

第4期沈延等:TALEN 构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程
541
图6
pCS2-TALEN 载体及酶切位点⽰意图
【⽰例5】
TALEN 终载体的酶切检测结果分析(图7,表4)
：
图7pCS2-TALEN 载体酶切鉴定结果⽰例表4
TALEN 终载体酶切、电泳后的各种情况分析
电泳编号酶切产物(⼤约的kb 数)
质粒类型(以15个TALE 单元为例)
及判断结果15+2TALE 重复序列正向接⼊(√)25+0.5pCS2-FokI 空载体(×)3 6.5+0.5TALE 重复序列反向接⼊(×)
45+<2未接⼊完整的TALE 重复序列(=断连)(×)5
5+>2
多个TALE 重复序列串连接⼊(=串连)(×)
2.4TALEN 活性检测与斑马鱼突变体筛选2.4.1
TALEN 体内活性检测(以斑马鱼为例)这⼀步⾸先通过体外转录合成编码TALEN 的
mRNA,再将成对的mRNA 显微注射到斑马鱼单细胞受精卵中,2~4d 后提取基因组DNA,采⽤限制性内切酶酶切法检测TALEN 位点是否发⽣突变,同时可以估算TALEN 的突变效率。

这⼀步也可以选⽤直接克隆测序等其他⽅法代替酶切检测。

(14)线性化TALEN 表达载体：通过Not Ⅰ或Sac Ⅱ酶切线性化鉴定正确的pCS2-TALEN 载体对(需要先确认⼀下Not Ⅰ或Sac Ⅱ为单⼀酶切位点)。

线性
化完全后可直接⽤快速DNA 产物纯化试剂盒回收。

(15)体外转录TALEN mRNA(SP6,Ambion)、回收,溶于20~30µL DEPC H 2O 中,Nanodrop 定量。

(16)将左、右两侧半位点的⼀对TALEN mRNA 混和,显微注射到单细胞期斑马鱼受精卵中[18],得到F 0胚胎(注射量建议：
50~150pg/半位点)。

同时留⼀些未注射的同批胚胎作为对照。

(17)取2~4dpf 注射后表型正常的胚胎,1~5个胚胎为⼀组,
提取基因组DNA,PCR 扩增靶点周围的序列(最好⽤“2.2.2”中鉴定过的引物)。

(18)酶切检测TALEN 在靶点造成的突变。

如果有完整的、未切开的PCR 条带(前提是未注射的对照胚胎的PCR 产物能够全部被切开),则说明靶点可能发⽣了突变。

将未切开的条带切胶回收,连⼊T 载体,测序鉴定靶点的突变情况(图8)。

未切开的PCR 条带占所有条带的荧光亮度的百分⽐可⼤致反映TALEN 的突变效率。

【⽰例6】Bam H Ⅰ酶切检测tnikb 位点的突变情况(图8)：
图8tnikb TALEN 位点indel 突变检测结果
PCR ：未经酶切的PCR 产物;对照：对照组胚胎(未注射TALEN mRNA)PCR 产物酶切后的结果;+TALEN ：实验组胚胎(注射了TALEN mRNA)PCR 产物酶切后的结果。

此例中TALEN 的突变效率约为12%。

542HEREDITAS
(Beijing)2013第35卷
2.4.2斑马鱼TALEN 突变体筛选
这⼀步⾸先是检测F 0(Founder )外交得到的F 1
胚胎,以便筛选出⽣殖细胞中带有(可遗传的)靶位点突变的F 0成鱼。

将这样的F 0成鱼外交得到的后代(F 1)养⼤,再通过剪尾逐条检测F 1的靶位点序列,即可筛选出携带可遗传TALEN 突变的斑马鱼个体。

(19)将TALEN 活性>1%(最好能>10%,这样更便于筛选)、存活率较⾼(不低于70%)的同批F 0胚胎饲养⾄性成熟(⼀般电泳结果中⾁眼可见未切开的条带即可认为TALEN 活性>1%)。

(20)与野⽣型(WT)成鱼外交,收集F 1胚胎。

每条F 0建议检测20个以上的F 1胚胎。

(21)将每3~5个F 1胚胎混和为⼀组,提取基因组DNA,对TALEN 位点进⾏PCR 扩增和酶切、电
泳检测。

(22)回收未切开的条带(携带潜在突变的PCR 产物)进⾏测序鉴定。

选取F 1胚胎发⽣突变的F 0鱼外交,⼤量饲养F 1。

(23)剪尾鳍提取F 1的基因组DNA,逐条进⾏基因型分析(=通过PCR 、酶切、测序检测靶位点序列)(图9)。

(24)选取携带感兴趣的TALEN 突变的、成对的F 1斑马鱼,通过内交进⾏表型分析;如果不成对,则可外交后选取成对的F 2杂合⼦,再通过内交分析表型。

做过原位杂交的胚胎仍然可以⽤常规⽅法提取基因组DNA,⽤于PCR 鉴定。

因此,F 1或F 2杂合⼦内交得到的胚胎做过原位杂交检测后,可以提取基因组DNA,然后通过PCR 和酶切的⽅法进⾏基因型分析。

【⽰例7】Bam H Ⅰ酶切检测
F 1成鱼中tnikb 位点的基因型(图9)：
图9酶切检测tnikb 位点的基因型
3
常见问题和注意事项
3.1
TALEN 靶点选择需要考虑的其他问题(1)靶位点选择因基因⽽异,⼀般⽽⾔,靶点靠
前⽐较好,尽量在基因编码序列(CDS)的前2/3,但是要在ATG 之后,这样突变等位基因(Allele)可编码的多肽产物较短,更接近⽆效突变(Null mutation)。

同时还要考虑避免在第⼀个起始密码⼦的下游还存在额外的具有相同阅读框(in-frame)的起始密码⼦。

(2)靶点也可选择在内含⼦和外显⼦的交界处,以破坏靶基因的剪接。

(3)还要注意靶基因是否有多个不同的剪接变体或转录变体,注意需要突变的是某⼀个剪接变体或转录变体,还是所有的剪接变体或转录变体。

3.2关于TALEN 的脱靶效应
关于TALEN 的脱靶(Off-target)效应,⽬前的研
究并不多。

从仅有的⼏篇报道来看,TALEN 的特异性很⾼,脱靶效应远远低于ZFN 。

可通过前述的TALEN 靶点预测⽹站(/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html /TALENT/)预测特定基因组中潜在的脱靶位点,然后通过深度测序检测TALEN 的脱靶效应[10]。

3.3
TALE 重复序列组装载体的问题
(1)TALE 重复序列组装过程中是以pMD18-T 载体作为⾻架。

该载体⾻架仅⽤于承载TALE 重复序列,并不⽤来表达TALEN 蛋。