噻嗪酮降解菌BF3的分离、鉴定及降解特性

噻嗪酮降解菌BF3的分离、鉴定及降解特性
中国环境科学2011,3l(6):965-970ChinaEnvironmentalScience
噻嗪酮降解菌BF3的分离,鉴定及降解特性
李超,潘荣清,唐超西,闰新,李顷鹏(南京农业大学生命科学学院,农业部农业环境微生物工程重点开放
实验室,江苏南京210095)
摘要:分离到1株能降解噻嗪酮的细菌BF3,通过生理生化试验和16SrRNA基因同源性序列分析,初步鉴定其属于副球菌属(Paracoccussp.)
该菌在接种量为2%的条件下,7d内对50mg/L噻嗪酮的降解率为68.2%.其最适降解pH值为7.0,降解最适温度为30~C.BF3对低浓度
(1,10,30,50rag/L)的噻嗪酮有较好的降解效果,但对高浓度(100,200mg/L)的噻嗪酮降解效果一般,降解速率与起始接种量呈正相关.需氧量试
验表明,BF3在通气良好的状况下降解速率较高.
关键词:噻嗪酮:副球菌属;降解特性
中图分类号:x172文献标识码:A文章编号:1000—6923(2011)06—096506 Isolation,identificationandcharacterizationofabuprofezin-degradingbacteriumBF3.LIC hao,PANRong—qing,
TANGChao-xi,Y ANXin',LIShun—peng(KeyLaboratoryofMicrobiologicalEngineeringAgriculturalEnvironment, MinistryofAgriculture,CollegeofLifeScience,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing2 10095,China).China
EnvironmentalScience,2011,31(6):965～970
Abstract:Abuprofezin-degradingbacteriumBF3wasisolatedforthefirsttimeinthiswork.T hroughbiochemical—
physiologicalidentificationandtheanalysisofits16SrRNAgenesequence,BF3WaSidentif iedpreliminarilyas
Paracoccussp..BF3coulddegrade68.2%of50mg/Lbuprofezinin7days.Themostadaptable
pHandtemperaturefor
thedegradationwere7.0and30℃,respectively.BF3hadabe~erdegradationeffectatlowcon centrations
(1,10,30,50mg/L)ofbupro~zinandthedegradationratewasrelatedpositivelytoinitialinocu lationamount.Theoxygen consumptionexperimentshowedthatthebuprofezindegradationrateofgoodventilationstat eWaShigherthanthatat
relativelypoorventilationstate.
Keywords:buprofezin;Paracoccussp;degradation
噻嗪酮,又称稻虱灵,优乐得,化学名称为2一
叔一丁亚氨基～3一异丙基一5一苯基一3,4,5,6一四氢
一
2H一1,3,5一噻二嗪一4一酮,对酸,碱,光,热稳定IJJ.
噻嗪酮是一种抑制昆虫生长发育的选择性杀虫
剂L2J,触杀作用较强,有胃毒作用,其作用机制为抑
制昆虫几丁质的合成和干扰新陈代谢,从而致使
昆虫蜕皮畸形或翅畸形而缓慢死亡J.长期以
来,人们普遍认为噻嗪酮在杀死目标害虫的同时,
因不伤害益虫而具有很好的防治功效,使其在综
合虫害管理方案(IPM)中应用广泛I681.然而,近年
来的研究证明,残留的噻嗪酮对一些有益昆虫或
幼虫有负面影响,如Smith19l研究结果表明,残留
的噻嗪酮导致了大量幼虫的死亡以及减少了瓢
虫进行规模饲养时的产卵量;此外,其他研究也证
明了噻嗪酮的残留影响若干种瓢虫和半翅类昆
虫的产卵量和孵化【o1.
在中国,噻嗪酮主要用于水稻,茶树,柑橘,
蔬菜等农作物的病虫害防J,据中国24种出
口日本的蔬菜农残超标研究显示,扁豆和小松菜
中噻嗪酮残留量严重超标【l引,这不仅影响了农产品的质量,同时还对人们的健康造成影响.因此.
如何消除潜在的噻嗪酮残留问题己迫在眉睫.微
生物具有繁殖迅速,变异快和代谢途径多样等特点,释放到环境中的农药等异生物大部分被微生
物分解,微生物修复被认为是污染物修复的有效
手段[14-21J.目前还没有关于噻嗪酮微生物降解的报道,本研究从长期施用噻嗪酮的稻田地中分离
收稿日期:201010-02
基金项目:江苏省科技支撑计划(BE2009670)
责任作者,讲师,***************.ca
中国环境科学31卷
到1株能够降解噻嗪酮的细菌,对该菌的分类地
位及降解特性进行了研究,以期为噻嗪酮的微生
物降解提供理论依据,同时为噻嗪酮污染的生物
修复打下基础.
1材料与方法
1.1培养基与试剂
基础盐培养基(MSM,g/L):NaC11.00,
NH4NO31.00,K2HPO41.50,KH2PO40.50,MgSO4. 7H2O0.10.pH值7.0.
LB培养基(g/L):酵母膏5.00,蛋白胨l0.o0,
NaC15.oo(固体加1.5%的琼脂).pH值7.0.
初始降解培养基(g/L):基础盐培养基(MSM),
葡萄糖0.50,蛋白胨0.50.
1-2菌株的分离筛选
取长期施用噻嗪酮的稻田地土壤5.00g,置于
100mL噻嗪酮浓度为50mg/L初始降解培养基中, 于3O℃,180r/min摇床富集7d,然后每7d以5%的
接种量转接到相同的培养基中,转接3次.然后取
0.5mL富集液梯度稀释,取10一～1O{稀释度的液体各O.1mL,涂布于加有50mg/L噻嗪酮的初始降解
培养基固体平板上,30~C培养3~4d后,挑取单菌落
接种于含50mg/L噻嗪酮的初始降解培养基
中,30~C,180r/min摇床培养7d,检测其降解效果【2引.
1.3菌株的鉴定
菌株形态及生理生化特性测定参照文献[23]
进行.菌株16SrRNA基因的克隆及序列测定和
比较参照文献[24—251,提BF3基因组DNA作为
模板,进行16SrRNA基因的扩增.正向引物:
5'一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG一3',反向弓l
4勿'一TACGGCTACCTTGTTACGACTT一3';25gL 体系为:模板1gL,dNTP(25mmol/L)2~tL,引物(1
mmol/L)各lgL,lOxTaq缓冲液2.5gL,Mg(25
mmol/L)1.5pL,Taq酶(5U/pL)0.3gL,超纯水
15.7gL.聚合酶链式反应条件:95~C,5min;94~C,
0.5min;52℃,1min;72℃,lmin;循环30次,72℃延
伸10min.采用PCR产物回收试剂盒回收扩增片
段,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小后
(1.5kb左右),将其TA克隆并测序,将测序结果通
~())~t(http://rdp.cme. msu.eau)上的相关16SrRNA基因序列进行同源
性比对分析.
1.4噻嗪酮提取和检测
样品提取参考文献[26]进行:采用等量萃取
法,加入等体积的二氯甲烷进行萃取,用高速旋涡
振荡器混合5min,静置后吸取下层有机相lmL
至1.5mL离心管中,氮气吹至干后,加入0.5mL乙
腈溶解样品,待测.
液相色谱分析条件【]:WatersC18反相柱;流
动相:乙腈:0.1%H3PO4水溶液(体积比为60:40), 流速0.6mL/min;检测波长:245nm;柱温:40℃;进
样量2O.
1.5菌株培养
从平板一klt取一单菌落,接种于50mLLB液
体培养基中,于30~C,200r/min摇床培养24~36h 后,将菌液离心,用无菌水洗涤2次,再加入无菌水, 测定至光密度6o0mn≈2.00,用为种子液IJ.
1.6菌体生长量的测定
噻嗪酮在无机盐液体培养基中的溶解度很
小,会形成白色沉淀,干扰菌体600nm值的测定,因此本研究采用稀释涂布法来测量菌株的生长量. 2结果与讨论
2.1菌株的分离及其生理生化特性
分离,筛选获得了1株不能利用噻嗪酮为唯
一
碳源生长的菌株,命名为BF3,该菌株属于革兰
氏阴性菌,短杆状.菌落边缘齐整,乳白偏黄色;菌
落隆起,呈圆形,不透明,表面光滑.V.P反应阴性, 甲基红实验阴性.
2.2菌株16SrRNA基因的序列分析
以菌株BF3的基因组DNA为模板,利用细
菌16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增,得
到长度约为1.5kb的扩增产物.测序后在GenBank上登录,序列号为FJ593184.根据相似性比对,菌株BF3分别与Paracoccusyersutus和Paracoccusbengalensis相似性均为100%.目前,
细菌分类学家的共识是认为当某2个细菌的16S rRNA的相似性大于95%时,可将其归为同一
属[291.因此,根据上述相似性比较结果,再结合菌
株的生理生化特性将其初步鉴定为副球菌属
6期李超等:噻嗪酮降解菌BF3的分离,鉴定及降解特性(Paracoccussp.).
2.3降解培养基的优化
料
琏
逝
图l碳源对BF3生长与其对噻嗪酮降解的影响
Fig.1Effectofcarbonsourceongrowthanddegradation
0fBF3
氮源种类
图2氮源对BF3生长与其降解噻嗪酮的影响
Fig.2Effectofnitrogensourceongrowthand degradationofBF3
分别以可溶性淀粉,牛肉膏,乳糖,蔗糖,
葡萄糖,麦芽糖,柠檬酸钠代替初始降解培养基
中的碳源,质量浓度为0.50g/L.在噻嗪酮浓度为
50mg/L的条件下接入2%种子液,于30℃,
180r/min条件下培养24h后用吸光度法测定菌浓
度,并用液相检测噻嗪酮的浓度,计算降解率,绘
图(图1).再分别以蛋白胨,硫酸铵,硝酸铵,酵
母膏,脲素代替初始降解培养基中的氮源,质量
浓度为0.50g/L.方法同上(图2).不同碳,氮源对
菌株BF3生长与降解的影响见图1和图2.由图1
可见,在使用牛肉膏为碳源时oonm值最大,即菌
浓度最高,同时降解率最高,所以选用牛肉膏作为
发酵培养基中最佳碳源.由图2可知,菌株BF3以蛋白胨为氮源时菌浓度最高,且降解效果最好,因此试验选用蛋白胨作为培养基中的最佳氮源.最终的降解培养基(g/L):NH4NO31.00,K2HPO4 1.50,KHzPO40.50,MgSO4'7H200.20,NaCl0.50,
牛肉膏O.50,蛋白胨0.50.pH值7.0.
2.4菌株生长和噻嗪酮降解的关系
在噻嗪酮终浓度为50mg/L降解培养基中,
接入2%种子液,于30℃,180r/min摇床培养,每
隔1d取样分析培养液中噻嗪酮浓度和菌体的生长量,绘制降解曲线.从图3中可见,菌株BF3能够有效地降解噻嗪酮,7d内对噻嗪酮的降解率达68.2%.菌体在最初的1d内,虽然生长缓慢,但噻
嗪酮已被迅速降解;在2-6d内,菌体迅速生长并达到稳定期,这一阶段降解速率也逐渐变慢;6d
以后细胞进入衰亡期,同时降解率达到最大值,不再变化.推断可能是在降解后期产生了相关的代谢产物.反馈抑制了BF3对噻嗪酮的降解.
培养时间(d)
图3BF3的生长与噻嗪酮降解率的关系曲线Fig.3TherelationshipbetweenthegrowthofBF3andits abilitytoremovebuprofezin
2.5初始浓度对BF3降解噻嗪酮的影响
在降解培养基中加入噻嗪酮使其终浓度分
别为1,10,30,50,100,200mg/L.接入2%种子液,于30℃,180r/min摇床培养,每隔1d取样一次,测定噻嗪酮的残留量.从图4的结果可见,BF3对低浓度(1,10,30,50mg/L)的噻嗪酮有较好的降解效果, 对高浓度(100,200mg/L)的噻嗪酮降解效果一
般.BF3可以将lmg/L和10mg/L的噻嗪酮在7
天内完全降解,但随着噻嗪酮初始浓度的增加,降解率逐渐降低,这是由于在相同条件下,高浓度的中国环境科学31卷
噻嗪酮经降解产生了比低浓度噻嗪酮更多的相关代谢产物,更早的产生反馈抑制作用,因此降解率下降.
邑
{赵
蛙
盔
瞥
磐
培养时间(d)
图4噻嗪酮初始浓度对BF3降解噻嗪酮的影响Fig.4Effectofinitialbuprofezinconcentrationonits degradationbystrainBF3
2.6温度对BF3降解噻嗪酮的影响
在噻嗪酮终浓度为50mg/L降解培养基中,
接入2%种子液,分别在15,20,25,30,37~C温度下, 于180r/min摇床培养,每隔ld取样一次,测定噻
嗪酮的残留量.由图5可知,温度对噻嗪酮降解影响较显着.BF3在30℃条件下,7d内能将噻嗪酮降解68.2%;在15,20,25,37℃条件下,7d内的降解率分别为19.5%,39.5%,50.0%,47.1%.该数据
表明,不同的温度下BF3对农药的降解效果相差较大,但在30℃时,降解效果最好.
邑
避
驻
蜚
2.7pH值对BF3降解噻嗪酮的影响
在噻嗪酮终浓度为50mg/L降解培养基中,
接入2%种子液,设定pH值为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0, 10.0,于3O℃,180r/min摇床培养,每隔1d取样一次,测定噻嗪酮的残留量.由图6可知,当pH值为7.0时,BF3对噻嗪酮的降解率最高;当pH>7.0时, 其降解率随着pH值的升高呈明显的下降趋势;
当pH值为10.0时,噻嗪酮的降解率仅为10.2%.
此外,在酸性的环境条件下,噻嗪酮的降解率也有
所下降,当pH5.0时,噻嗪酮的降解率为38.0%.这
可能是由于过酸过碱条件都不利于BF3的生长.
邑
匿
皆
磐
培养时间(d)
图6pH值对BF3降解噻嗪酮的影响
Fig.6EffectofpHvalueonbuprofezindegradationby strainBF3
2.8接种量对BF3降解噻嗪酮的影响
邑
鹾
蟹
誉
培养时间(d)
图7接种量对BF3降解噻嗪酮的影响
Fig.7Effectofinoculationonbuprofezindegradationby strainBF3
图5温度对BF3噻嗪酮降解的影响
Fig.5Effectoftemperatureonbuprofezindegradationby在噻嗪酮终浓度为50mg/L降解培养基中,
strainBF3以1%,2%,5%,10%,15%的接种量接入2%种子液,
6期李超等:噻嗪酮降解菌BF3的分离,鉴定及降解特性969
于30℃,180r/min摇床培养,每隔1d取样一次.
测定噻嗪酮的残留量.由图7可知,随着接种量的
增大,噻嗪酮的降解速率逐渐加快,且和起始接种
量呈正相关.这是因为接种量越大,菌体就会产生
更多相关的降解酶,从而加快了降解速率,但与此
同时,由于存在反馈抑制作用,当代谢产物达到一
定数量时降解被抑制,最终降解率达到稳定值.
2.9通气量对菌株BF3降解噻嗪酮的影响
在250mL三角瓶中分别加入30,70,120,
150mL降解培养基,pH值为7.0,加入噻嗪酮使其
浓度为50mg/L,再接入2%种子液,在30℃,
180r/min条件下振荡培养,每隔1d取样一次并测
定噻嗪酮的残留量.由图8可知,在培养7d后,装
液量为30mL时噻嗪酮的降解率最高,为68.2%:
装液量为150mL的降解率最低,为45.0%.装液量
为70mL和120ml的差别不大,降解率均在60%
左右.在通气量较好,即装液量较少时,BF3降解
噻嗪酮的速率比在通气量较低时稍高,但差异不
是很显着.推断可能是在通气量较低时,三角瓶内
空间相对较小,对菌体的供氧不足,抑制了菌体的
生长,而导致了降解速率的下降.
昙
避
盔
瞥
图8通气量对BF3降解噻嗪酮的影响
Fig.8Effectofventilationonbuprofezindegradationby
strainBF3
3结论
3.1分离到一株噻嗪酮降解菌,经生理生化实
验及16SrRNA基因序列比对,确定该菌为副球
菌(Paracoccussp.),命名为BF3.
3.2BF3不能利用噻嗪酮为唯一碳源,需加入外
源碳源.其降解噻嗪酮的最适pH值为7.0,最适温
度为30℃,在接种量为2%时对噻嗪酮的降解效
果较好,降解噻嗪酮的速率和起始接种量呈正相
关,降解速率随着通气量的提高而加快.BF3对低
浓度(1,10,30,50mg/L)的噻嗪酮有较好的降解效
果,但对高浓度(1O0,200mg/L)的噻嗪酮降解效果
一
般.
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作者简介:李N(1986一),男,安徽无为人,南京农业大学生命科学
学院硕士研究生,主要从事农药降解菌的分离及土壤的生物修复研
究.
温室气体减排效果明显
美国环境署(EPA)近日公布了经"能源之星"认定的2010年节能建筑城市排行榜,洛杉矶再次夺魁.这次公布的
排行榜是自2008年开始进行"能源之星"城市评比以来的第三次,结果显示美国城市能源效率高的建筑又有了大
幅增加.
洛杉矶已是连续3年保持这一记录的城市.排在之后的城市分别为华盛顿特区,旧金山,芝加哥,纽约,亚特
兰大,休斯顿,萨克拉门托,底特律等.
2010年,有6200幢以上的商用建筑(包括办公大楼,学校,零售店等)接受了"能源之星"认证,比2009年增加
了近60%.美国全国得到"能源之星"认证的建筑产生的温室气体减排效果,相当于
约130万户家庭一年能源消费所
产生的温室气体排放量,可以节约19亿美元以上的能源成本.
据了解,美国"能源之星"计划最早始于1992年,由美国环境署发起,后来与能源署合作加以推广."能源之星"
已成为一种节能环保的标志,也是一项节能环保的荣誉.到2010年末,美国全国约有1.26万幢以上的建筑物获得能源
之星认证证书.
摘自《中国环境报》
2011-05-03。