高效液相色谱-质谱法测定尿液中痕量雷公藤春碱

高效液相色谱-质谱法测定尿液中痕量雷公藤春碱
施跃锦;蔡美强;金米聪
【摘要】提出了尿液中雷公藤春碱的高效液相色谱-质谱测定方法。

尿液样品经waters OasisMCX固相萃取小柱富集、净化后，以Zorbax Eclipse SB C18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)为分离柱，以乙酸盐缓冲溶液-乙腈(40+60)为流动相，采用正离子模式大气压化学电离源，在选择离子监测模式下进行检测，雷公藤春碱的定量离子质荷比(m/z)为874.4。

线性范围为0.2～50.0μg·L-1，检出
限(3S/N)为0.07 μg·L-1，测定下限(10S/N)为0.2μg·L-1。

回收率在86.0％～92.0％之间，日内(n=6)和日间(n=15)相对标准偏差分别小于7.5％和
10.5％。

%A method for the determination of wilfortrine in urine by HPLC-MS was proposed. Wilfortrine in sample was separated, enriched and purified on the Waters Oasis MCX SPE column. The eluate was used for HPLC-MS determination, in which the Zorbax Eclipse SB C18 column (4. 6 mm× 250 mm, 5 μm) was used as chrom atographic column, and a mixture of acetate buffer solution and acetonitrile (40 + 60) was used as mobile phase. Atmospheric pressure chemical ionization source with positive ionization mode as well as selected ion monitoring mode was used in the detection. Ion used for quantification was m/z 874. 4. Linearity range was found between 0. 2-50. 0μg ? L-1, and values of detection limit (3S/N) and lower limit of determination (10S/N) found were 0. 07μg ? L-1 and 0. 2 μg ? L-1 respectively. Values of recovery were ranged from 86. 0% to 92. 0%. Values of RSD's (intra-day, n=6) and RSD's (inter-day,n=15) were less than 7. 5% and 10. 5%, respectively.
【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2011(047)005
【总页数】4页(P517-519,522)
【关键词】高效液相色谱-质谱法；固相萃取；雷公藤春碱；尿液
【作者】施跃锦;蔡美强;金米聪
【作者单位】浙江工商大学环境科学与工程学院，杭州,310035;浙江工商大学环境科学与工程学院，杭州,310035;宁波市疾病预防控制中心宁波市毒物研究与控制重点实验室，宁波,315010
【正文语种】中文
【中图分类】O657.63
雷公藤春碱属倍半萜类雷公藤生物碱,具有一定的毒性,是一种主要的雷公藤活性成分,也是目前应用于临床的雷公藤制剂的主要活性成分之一,对治疗自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、慢性肾炎、红斑狼疮、接触性皮炎等有显著疗效[13]。

目前对雷公藤生物活性成分的药理研究较少,对雷公藤春碱单体的研究更少,一个主要原因是缺少一种灵敏、可靠的痕量雷公藤春碱的测定方法。

文献已报道对雷公藤春碱的测定,主要采用液相色谱法紫外检测器进行检测[46],由于紫外检测器抗干扰能力和灵敏度相对较差,而尿液中雷公藤春碱含量较低,且基质复杂,液相色谱法难以准确有效地监测,在药物的不良反应研究中遇到瓶颈。

因此,尽快建立一种准确、灵敏的雷公藤春碱的测定方法,对评价和控制雷公藤制剂的药物不良反应具有十分重要的现实意义。

液相色谱质谱联用技术(LCMS)是近年发展起来的一种新型检测技术,已在药物分析及毒物残留分析中得到广泛的应用[710]。

本工作采用高效液相色谱质谱
法在大气压化学电离质谱正离子模式下检测,利用选择离子监测(SIM)技术,建立了尿液中雷公藤春碱检测方法,为进一步深入开展倍半萜类雷公藤生物碱单体的药理研究奠定技术基础。

1100 series LC/MSD Trap SL型高效液相色谱质谱联用仪,包括四元泵、在线真空脱气机、柱温箱、自动进样器;全玻璃溶剂过滤器;HGC24型氮吹仪;KQ2200型超声波清洗器;12孔固相萃取仪;MilliQ纯水系统;Waters Oasis?MCX固相萃取小柱(3 mL/60 mg)。

雷公藤春碱对照品:取雷公藤春碱对照品(自制),经液相色谱紫外可见光检测器和质谱检测器测定[6],纯度大于95%。

雷公藤春碱对照品溶液:称取对照品10.0 mg于10 mL容量瓶中,加入少量乙腈溶解并稀释至刻度,配成质量浓度1.00 g·L-1,于4℃条件下避光保存,备用。

移取
100μL储备溶液于10 mL容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,配成质量浓度10.0 mg·L-1,于4℃条件下避光保存,备用。

乙酸盐缓冲溶液:0.5 g·L-1乙酸和5 mmol·L-1乙酸铵溶液的混合溶液。

空白尿液:空白尿液采自健康志愿者(年龄在20～25岁),在-20 ℃下保存。

甲醇、乙腈和乙酸为色谱纯,氨水、乙酸铵、盐酸为分析纯,所有的溶剂使用前均用0.45μm滤膜过滤;试验用水为高纯水。

色谱条件:ZorbaxEclipse SB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),Zorbax Eclipse SB C18预柱(4.6 mm×12.5 mm,5μm);流量0.8 mL·min-1;柱温30℃;流动相为乙酸盐缓冲溶液与乙腈以体积比 40比 60混合而成,进样体积为20.0μL。

质谱条件:大气压化学电离源(APCI),正离子模式;扫描范围质荷比 m/z200～1000;毛细管电压+3100 V,毛细管出口电压+118 V;干燥温度325℃,雾化温度425℃,干燥气流量6.0 L·min-1;喷雾压力0.24 MPa;延迟时间200 ms,定量模式为选择离子监测,定量离子 m/z为874.4。

移取经预先解冻的尿液试样5.0 mL于10 mL聚丙烯离心管中,加2.0 mol·L-1盐酸溶液1.0 mL,振摇,高速离心后吸取上清液,然后再加2.0 mol·L-1盐酸溶液2.0 mL,振摇,高速离心后吸取上清液,合并上清液待净化。

将上清液全部转入事先用甲醇3.0 mL和水3.0 mL活化、平衡的MCX固相萃取小柱后,分别用水 3.0 mL,甲醇3.0 mL淋洗,再用含10.0 g·L-1氨水的甲醇溶液3.0 mL洗脱,收集洗脱液用氮吹仪吹干,用甲醇水(80+20)溶液定容至1.0 mL,过0.45μm滤膜后,取滤液20.0μL,按仪器工作条件进行测定。

试验了CLC C8柱(5.0 mm×150 mm,5μm),Diamonsil C18柱(4.6 mm ×150 mm,5μm),XBridgeTMShield RP18柱(3.0 mm×250 mm,5μm)和 Zorbax Eclipse SB C18柱对雷公藤春碱与基质分离的影响。

结果表明:前3种色谱柱色谱峰有一定的拖尾,而且保留时间偏长,分离效果不理想,而Zorbax Eclipse SB C18柱的分离效果较好,色谱峰峰形对称,保留时间适宜。

试验选择 Zorbax Eclipse SB C18柱进行分离与测定。

试验了不同比例的乙腈水、甲醇水、甲醇乙酸铵和乙腈乙酸铵缓冲溶液作流动相,对雷公藤春碱分离测定的影响。

结果表明:不加乙酸铵缓冲溶液,分离效果较好,质谱检测的信号和稳定性较差;加入一定量的乙酸铵溶液,可以较好地提高质谱检测的灵敏度。

同时试验表明:乙腈乙酸铵缓冲溶液的分离与检测效果优于甲醇乙酸铵缓冲溶液的分离与检测效果。

试验采用乙酸盐缓冲溶液与乙腈以体积比40比60混合作为流动相,雷公藤春碱与杂质得到较好的分离,且保留时间较短,见图1。

由图1可知:雷公藤春碱色谱峰的两侧没有出现明显的色谱峰,说明方法具有较好的分离。

试验了电喷雾正、负离子模式及APCI正、负离子模式的4种质谱离子化方式,结果表明:4种质谱离子化方式对雷公藤春碱均有较好的质谱响应信号,但APCI正离子模式的质谱响应灵敏度较高。

图2为1.0 mg·L-1雷公藤春碱标准溶液在APCI
正离子模式下直接进样时的质谱图。

由图2可知:雷公藤春碱具有强的[M+H]+准分子离子峰 m/z874.4,试验选用APCI 正离子模式下以其准分子离子进行分析,选用选择离子监测模式进行检测。

雷公藤春碱具有较强的碱性,加入盐酸溶液后形成盐酸盐,有助于其在水溶液中溶解。

试验采用选择离子监测技术进行检测,在一定程度上减轻了基质对测定的干扰作用,
但尿液基质成分复杂,共存基质成分易对雷公藤春碱的质谱信号产生抑制和增敏作用,且不同人群的尿液,基质存在明显的差异,从而导致对质谱信号的影响也存在差异,影响检测结果的准确度和精密度。

因此,针对复杂基质中雷公藤春碱的分析,需事先
进行一定程度的净化处理才能保证检测结果的重复性。

试验采用MCX阳离子交换柱进行净化,为了使雷公藤春碱能在固相萃取小柱上以离子的形式得到保留,事先需
对样品进行酸化,使雷公藤春碱分子转变成雷公藤春碱阳离子,在通过MCX阳离子
交换柱时被保留在柱上。

然后采用适宜的淋洗液对杂质进行淋洗,有利于更好地发
挥固相萃取的功效。

试验分别采用甲醇和水进行淋洗,最后用含10.0 g·L-1氨水的
甲醇溶液3.0 mL洗脱,从而提高检测的灵敏度与准确度,减少干扰物对质谱测定的
影响。

按试验方法配制质量浓度分别为0.20,0.50,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0μg·L-1雷公
藤春碱加标尿液按仪器工作条件对此标准溶液系列进行测定。

结果表明:尿液中雷
公藤春碱质量浓度在0.2～50.0μg·L-1范围内呈线性关系,以雷公藤春碱的峰面积
对质量浓度进行线性回归,线性回归方程为A=1392.75ρ+43.75,相关系数为
0.9991。

在空白尿液中加入一定量的雷公藤春碱标准溶液,使其质量浓度为0.50μg·L-1,按试验方法平行测定8次,以3倍信噪比计算雷公藤春碱的检出限(3S/N)为0.07μg·L-1,以10倍信噪比计算雷公藤春碱的测定下限(10S/N)为0.2μg·L-1。

对含雷公藤春碱质量浓度分别为0.50,2.0,20.0μg·L-1的3个尿液样品进行测定,在
同一天内平行测定6次,计算其日内精密度;分别在两周内选择5d,每天重复测定3次,计算其日间精密度,结果见表1。

由表1可知:尿液中雷公藤春碱测定值的日内相对标准偏差小于7.5%,日间相对标准偏差小于10.5%。

通过表1中3个尿液加标样品的日内平均测定值与标准加入量比较,雷公藤春碱的回收率分别为92.0%,86.0%,87.3%。

本工作提出的固相萃取富集净化,高效液相色谱质谱法测定尿液中痕量雷公藤春碱的方法,具有准确、快速、灵敏的特点,能满足雷公藤春碱的药理研究测定要求。

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