细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选

微生物学实验报告
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
山东大学生命科学学院
2010.6.10
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。

此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。

营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。

本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，实验了营养缺陷型的诱变获得及筛选，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤，掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。

关键词：营养缺陷紫外诱变筛选生长谱测定大肠杆菌（E.coli）
一、背景与原理
营养缺陷型菌株指的是因自发突变或诱变丧失合成某些生活必需物质的能力的菌株。

营养缺陷型菌株不能在基本培养基上生长（增殖），必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长。

此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是作为研究代谢途径和遗传规律不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。

例如，顺反子概念的提出、基因工程转化结果的鉴定等，都是利用了营养缺陷型菌株。

.菌株自发突变为营养缺陷型的概率是很低的。

因此现代微生物遗传学实验中，为了有目的的获得营养缺陷型菌株，实验人员往往以人工诱变的方法来获得营养缺陷型。

实验中，以各种致突变因子（物理、化学等）处理待突变细胞，然后进行筛选和鉴定，获得营养缺陷型菌株。

能够用来进行诱变的物质很多，例如各种射线、紫外线、DNA染色剂、碱基类似物、强氧化剂等，但是一般实验室中最常见也最有效地史紫外线诱变法。

在紫外线照射下，DNA发生不同程度的损伤，而且会形成大量的嘧啶二聚体。

处理完细胞后，在防止光复活的前提下，细胞中DNA的损伤得不到有效修复或者只能得到SOS 修复，会形成大量的基因突变，在细胞总量较大的前提下，就有机会获得一定得目的菌株。

用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。

诱变处理必须选择合适的剂量，不同微生物的最适处理剂量不同，须经预备实验确定。

物理诱变的相对剂量与三个因素有关：诱变源和处理微生物的距离、诱变源(紫外灯)功率、处理时间，往往通过处理时间控制诱变剂量。

化学诱变剂的剂量也常以相对剂量表示。

相对剂量与三个因素有关：诱变剂浓度、处理温度和处理时间。

一般通过处理时间来控制剂量，在处理前对诱
变剂和菌液分别预热，当二者混合后即可计算处理时间，可精确控制处理剂量。

紫外线处理后的细胞，含有很多死细胞，少量未发生突变的细胞，已经目的要得到的突变型细胞。

所以，必须经过筛选，才能够有效去除野生型的菌株，只留下有效地突变型菌株。

利用营养缺陷型菌株不能够正常生长的特点，可以采用加抗生素杀死野生型能够生长的细胞的方法来去除野生型。

这样就能够获得较为完全的突变型细胞。

获得的细胞是不是一定是营养缺陷型还是不能够确定的，还必须经过复证的过程来进行确认。

具体的方法，最早的是影印接种法（replica plating）。

影印法最初是为证明微生物的抗药性突变是自发的、与相应的环境因素无关而设计的实验，目前已广泛应用于营养缺陷型的筛选以及抗药性菌株筛选等研究工作中。

它的具体过程是：将待测的浓缩菌悬液涂在合适的平板上，等其长好后作为母平板（每平板上的菌落控制在50～300个）；用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，构成印章（即接种工具）；然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下；再把此印章在另一含有选择培养基的平板上轻轻印一下，经培养后，选择培养基平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较影印平板与母平板上菌落生长情况，即可从相应位置的母平板上选出待测的突变型菌落。

此法虽然简便易于进行，但是主要的问题在于两次影印的力度和深浅不易控制，容易压坏培养基或者压坏菌体，而且整个过程不易于无菌操作。

本次试验中，采用的复证方法是逐个测定法。

把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。

凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。

此方法虽然在菌落较多的情况下会很繁琐，但是便于单个菌落的个别分离。

经上述方法确定为营养缺陷型菌株的菌落，必须经过鉴定才能确定它到底是那一种营养物质的缺陷性，否则检出是没有任何意义的。

这里可以用到用生长谱法鉴定。

在同一含菌平板上划分多个区域，在每一个区域上添加单独的一种营养物或几种营养物的组合，培养后观察菌落能够出现在哪一个或一些区域内，通过组合的分析，能够确定获得的突变型是那一种突变型。

二、结果与分析
2.1各步骤结果
诱变结果
理想的诱变结果为得到较圆、较小的菌落，本次实验可能由于照射时间较长，只得到一个菌落为了进一步实验，选用了侯信锋等组的较为整齐的菌菌落。

缺陷型检出结果
图：突变型检出和对比（左图为LB培养基，右图为基本培养基【反相】）
通过对比可以看出，在LB培养基上，39、45、58、70、132、136、152、163号没有生长。

相应的，在基本培养基多个位置没有菌落生长，其对应的LB培养基上的菌有可能为营养缺陷型。

选取相应的菌株进行了复证（编号未列举）。

复证结果
图3.基本板1~24号图4.基本板25~48号
图5.LB板1~24号图6. LB板25~48号
进行对比之后发现，
①LB板只有48号未生长。

生长不好的有2、23、46号，剩余的菌生长良好。

②基本板有2、21、22、23、30、34、38、40、41、46、48号未生长。

生长不好的有1、3、
5、8、9、10、11、18、2
6、2
7、2
8、2
9、31、32、35、42、43、47。

剩余的均为生长良好。

选择的方法是选择在LB上生长但是在基本培养基上不生长的菌株。

因此得出可能的诱变菌株为2、21、22、23、30、34、38、40、41、46号；
最终选取了30号作为生长谱鉴定备选菌，因其表现最典型。

生长谱测定结果
图7为本组得到的结果，可以看出，整个培养基除了6区域之外都呈浑浊状，显示整个培养基都已生长细菌。

对照组的9区有菌生长。

因此实验是失败的。

此处我们以岳文伟组的实验结果为例（图8）进行分析。

该图中，仅有在4区域中有浑浊的生长斑，而其他地方都没有生长。

图7 生长谱结果，示透明圈图8 岳文伟组结果，示生长斑
通过对图8观察，可以看出菌落生长的区域为4号区，而氨基酸加入情况如下表：
1 Lys Arg Met Cys Purine Cystine
2 His Arg Thr Glu Asp Pyrimidine
3 Ala Met Thr Hydro-pro Gly Ser
4 Leu Cys Glu Hydro-pro Ile Val
5 Phe Cystine Asp Gly Ile Tyr
6 Trp Purine Pyrimidine Ser Val Tyr
7 pro
8 混合维生素（B1、B2、B6、泛酸、对氨基苯甲酸，烟碱酸及生物素等）
通过分析，我们发现亮氨酸是4区中所独有的，所以该营养缺陷型很可能为一亮氨酸缺陷型。

附：本组实验未得到结果原因分析
本组的实验结果是整个平板都长出了菌。

通过观察，发现菌的生长，除了6号区域之外，都
比较均匀；因此可以排除没有混匀所造成的影响。

本人认为，可能的原因如下：
①30号菌本身是一个原养型的菌，但是在复证的时候可能由于某种未知的原因导致其没有在基本培养基上生长。

之后的生长谱测定中，可能由于初始温度稍高之类的差异导致了原来限制生长的因素消失，于是普遍都能生长。

②在培养基倾倒入培养皿的时候无菌操作处理的不够好。

③此外，我认为6区域未生长，有可能表明30号菌株不仅是一个营养缺陷型，而且有可能是一个代谢缺陷型。

通过表格可以看出，6号氨基酸含有其他组没有的色氨酸，这是一种在代谢中比较重要的氨基酸。

这株菌可能由于突变位点比较多，导致不能正常代谢色氨酸而导致细胞不能生长。

而且，该菌株可能不是氨基酸或者维生素或者核酸缺陷型，所以在这次试验中不能被检出，但是还是不能在基本培养基上生长。

该菌可能不能忍受高浓度的色氨酸。

2.2实验总结
1）整个操作过程中务必要全程无菌操作。

2）整个实验过程中，给培养基详细编号和贴好标签是非常重要的。

3）进行紫外线诱变时要注意安全。

另外，本次试验中紫外诱变的时间过长，导致最后几乎没有获得任何的孑留菌落。

本次试验也侧面反映了紫外线灭菌的能力！另外诱变处理的菌液必须要黑布包裹以防止光复活产生回复。

4）检出点种时，要先点基本后点完全，防止将完全培养基带入到基本平板内引起全部生长的现象，点种时，将牙签放倒与水平面大约30°点种，防止刺穿培养基；贴计数纸前，先在平板底部相应位置标记，使得摘下纸观察后，还能按原方向贴上纸。

点种必须集中注意力，因为这是一项重复劳动性质的工作，在重复工作中非常容易出错，还应注意标号的对应不要搞错。

5）生长谱测定的关键步骤，或者说容易出问题的步骤，在于倾注平板的制备。

培养皿必须在使用之前严格的无菌，培养基的温度要严格控制，否则容易烫死加入的细菌或者由于凝固而使混匀失败；而且培养基的量也不能过多或者过少。

振荡均匀合适必要的，否则菌的生长不再以氨基酸的加入为限制条件。

氨基酸的加入点到为止即可。

6）亮氨酸缺陷型是很容易检出和获得的，因为亮氨酸在蛋白质中的量是比较大的，所以如果细胞不能利用亮氨酸的话，会很容易在细胞的生物活性或者生长特性上表现出来。

7）本次实验测定生长谱时，采用了倾注的方法而没有使用涂布的方法，是由于这样比较能够较好的保证菌体能够分布的均匀。

而且如果涂布的话，在培养基表面容易留下水迹，造成了氨基酸的溶解扩散，使实验失败。

方法与材料
1菌悬液制备
1）取E.coli K12一环加入到10ml LB培养液中，37℃下过夜培养；
2）振荡菌液，取100μl 菌液转接到10ml LB培养液中，在37℃摇床上振荡5h，此时细胞处在对数生长期，对于外界诱变因子敏感；
3）取适量菌液加入到2个5ml离心管中，8000rpm离心2min，弃掉上清液，各加入2ml无菌水，充分振荡混匀，合并，得到4ml菌悬液保存备用。

2诱变处理
取3ml菌悬液，加入到7cm培养皿内，轻轻震荡，使其均匀在皿底形成一薄层。

平放在紫外灯打开的、已经经过灭菌的超净工作台上，连同盖一起灭菌1min，然后打开皿盖照射2min，然后加入2倍LB培养基3ml，是的皿内的培养基为LB。

盖上黑布，在黑暗中37℃培养12h（防止光复活）。

3淘汰野生型
1）从6ml中取3ml菌液加入到离心管中，8000rpm离心2min，其去上清；
2）加入4ml生理盐水离心洗涤3次后，最后一次得到3ml菌悬液，取100μl加入到5ml无氮基本培养基内，37℃培养12h；
3）加入2N培养基5ml和适量，氨苄青霉素，使菌液中的青霉素终浓度为20μg/ml，37℃下振荡培养。

此时菌液中野生型细胞已被杀死。

4检出缺陷性菌株
1）从培养12、16、24h的菌液中，分别取100μl，分别在LB完全培养基和基本培养基上涂布2个平板，做好标记。

在37℃下培养36h；
2）观察得到的菌落，选取完全培养基上的菌落数大大超过基本培养基的那一组，用灭菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落200个，分别点种两个在底部贴有200个小格的标记纸的培养皿的相同标号的小格内，先接种基本培养基，后接种完全，37℃过夜
培养。

5复证
挑取LB完全培养基上有而基本培养基上没有的菌落，在基本培养基上划线复证，并在完全培养基上保留备份，37℃过夜培养。

24小时后仍不长的为缺陷型；
6生长谱鉴定
1）将待测缺陷型接于10ml LB培养基中, 37℃过夜培养；
2）取适量菌液加入离心管中，8000r/min离心2min，收集菌体，加入生理盐水离心洗涤3次；
3）制成3ml菌悬液，取1ml倾注2个基本平板，皿底分9格，在1~8依次放入预先配好的氨基酸及维生素，第9格作为对照不接入任何的营养物质，37℃过夜培养。

4）观察培养结果，根据生长情况以及组合分析，确定是何种缺陷型。

试剂与材料
4.1.1实验菌株：大肠杆菌（E.coli）K12菌株
4.1.2培养基：
1）2倍LB液体培养基：酵母膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl0.5g、蒸馏水50ml、pH7.2；
2）LB液体培养基：酵母膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl0.5g、蒸馏水100ml、pH7.2；
3）LB固体培养基：酵母膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl0.5g、蒸馏水100ml、琼脂2g、pH7.2；
4）无氮基本培养基：K2HPO4 0.7g（或K2HPO4·3H2O 0.92g），KH2PO4 0.3g、柠檬酸钠·3 H2O 0.5g、MgSO4·7H2O 0.01g、葡萄糖2g，蒸馏水100ml、pH7.0，5mL；
5）2N基本液体培养基：K2HPO4 0.7g（或K2HPO4·3H2O 0.92g），KH2PO4 0.3g、柠檬酸钠·3 H2O 0.5g、MgSO4·7H2O 0.01g、葡萄糖2g、（NH4）2SO4 0.2g、蒸馏水100ml、pH7.0；
6）基本固体培养基：Vogel 50X *2ml、葡萄糖2g、蒸馏水98ml、琼脂2g、pH7.0；4.1.3试剂：
1）0.85%生理盐水；
2）混合氨基酸和混合维生素
4.1.4仪器与材料：
1ml/200μl枪尖各一盒、牙签一瓶、500ml锥形瓶、100ml锥形瓶、试管、7cm培养皿、9cm培养皿、量筒、移液枪、玻璃棒、紫外灯、黑布、恒温培养箱、离心机、涂布棒、电子天平、酒精灯、接种环、圆形纸片、药匙。