五波长高效液相色谱指纹谱定量鉴定速效救心丸_孙国祥

［中药指纹图谱］
五波长高效液相色谱指纹谱定量鉴定速效救心丸
孙国祥，赵梓余
（沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳110016）
收稿日期：2011-08-12基金项目：国家自然科学基金重大研究计划项目（90612002）
作者简介：孙国祥（1962—），男，博士，教授，博士生导师，从事中药指纹图谱信息学研究。

Tel ：（024）23986286，
E-mail ：gxswmwys@163．com 摘要：目的
建立速效救心丸五波长HPLC 指纹谱（FW-HPLC-FP ），综合鉴定速效救心丸质量。

方法
用均值法和主成
分整合法分析五波长下各样品定性定量信息，用系统指纹定量法鉴定了12批样品。

结果以藁本内酯为参照物峰，根
据速效救心丸中化学成分的最大紫外吸收选择检测波长为265nm 、276nm 、290nm 、300nm 和310nm ，并分别指认了29、31、29、27和24个共有指纹峰。

以系统指纹定量法鉴定了12批速效救心丸样品质量差异。

结论所建立方法快捷、有
效和可靠，可作为速效救心丸整体质量控制参考。

关键词：速效救心丸；五波长高效液相色谱指纹图谱；均值法；主成分整合法中图分类号：R286
文献标志码：A
文章编号：1001-
1528（2012）05-0777-04Quantitative identification of Suxiao Jiuxin Pill by five wavelength HPLC finger-prints
SUN Guo-xiang ，ZHAO Zi-yu
（College of Pharmacy ，Shenyang Pharmaceutical University ，Shenyang 110016，China ）
ABSTRACT ：AIM To establish five wavelength HPLC （FW-HPLC ）fingerprints of Suxiao Jiuxin Pill （SXJXP ）
and to quantitatively identify its quality．METHODS
The average method （AM ）and principal component inte-
grated analysis method （PCI ）were used respectively to integrate the different chemical qualitative and quantitative information from different FW-HPLC-FPs ，and the qualities of 12batches of samples were identified by the system-atically quantified fingerprint method （SQFM ）．RESULTS
The chromatographic fingerprints （CFPs ）were de-veloped by RP-HPLC ，and 29，31，29，27and 24co-possessing peaks were marked respectively under 265nm ，276nm ，290nm ，300nm and 310nm by choosing ligustulide （LGS ）peak as the referential peak．There were some differences in the inherent quality among 12batches of Suxiao Jiuxin Pill which were identified by SQFM．CONCLUSION
The established method is quick ，effective and reliable．It can be used as a reference for the
quality control of Suxiao Jiuxin Pill．
KEY WORDS ：Suxiao Jiuxin Pill ；five wavelength HPLC （FW-HPLC ）；average method ；principal component in-tegrated analysis method
速效救心丸是由川芎、冰片等制成的滴丸剂，用
量小、起效快、服用方便，是治疗冠心病和心绞痛常用药物［1-2］。

川芎辛、温，具有止痛、活血、行气作用。

冰片辛、苦，微寒，具有开窍醒神、清热、止痛作用。

两者合用，可充分发挥两药辛香走窜之力，以达
活血化瘀、开窍醒神之功［2］。

中药部颁标准中用TLC 鉴定川芎成分并用GC 法测定冰片中成分含有量［1］。

文献中测定其中金属元素［3］和氟［4］，利用红
外光谱进行聚类分析研究［5］。

曾用单波长HPLC 数
字化指纹谱评价其质量，本实验建立五波长HPLC 指纹图谱对其质量进行控制。

中药色谱指纹图谱必然走向对中药进行整体定量控制，系统指纹定量法
是鉴定中药整体化学物质的简便可靠方法［6］。

通过建立五波长HPLC 指纹图谱对速效救心丸进行全面质量评价，充分挖掘全指纹在最佳波长下信息，以增强方法灵敏度和准确度。

7
77
1仪器、试剂与试药
Agilent1100高效液相色谱仪，ChemStation工作站（Agilent科技有限公司），Sarturius-BS110S分析天平（北京赛多利斯天平有限公司），甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂），乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司），磷酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），水为去离子水。

阿魏酸对照品（Ferulic acid，FA，批号0773-9910），购自中国药品生物制品检定所。

藁本内酯对照品（Ligustulide，LGS，纯度不低于99.2%，自制）。

12批速效救心丸（天津中新药业集团股份有限公司第六制药厂），批号：S1（616062）、S2（619256）、S3（610064）、S4（619166）、S5（619187）、S6（619254）、S7（610020）、S8（610097）、S9（619240）、S10（610013）、S11（610098）和S12（610031）。

2实验方法与结果
2．1色谱条件大连江申CenturySIL C
18
BDS柱（200mmˑ4.6mm，5μm）；流动相A为水－0.1%磷酸，B为乙腈－0.1%磷酸；梯度洗脱（0 15min，5% 15%B；15 30min，15% 30%B；30 50 min，30% 50%B；50 60min，50% 65%B；60 70min，65% 85%B；70 90min，85%B）；体积流量1.0mL/min；检测波长265nm，276nm，290nm，300nm和310nm；柱温（30ʃ0.15）ħ；进样量20μL；洗脱时间90min。

2．2溶液的制备
2．2．1对照品溶液用甲醇配制40μg/mL阿魏酸对照品溶液，同法配制50μg/mL藁本内酯对照品溶液。

2．2．2供试品溶液取速效救心丸10粒，精密称定，加体积分数75%乙醇溶液定容至10mL，超声5min，摇匀，作供试液。

2．3系统适用性试验将S1样品溶液，阿魏酸和藁本内酯对照品溶液分别进样20μL，记录谱图，见图1。

确定6号峰为阿魏酸，21号峰为藁本内酯，选藁本内酯峰作参照物峰，其理论板数应不低于38万。

2h空针图证明无干扰峰，依据2h供试液图确定洗脱90min。

图1速效救心丸HPLC色谱图
Fig．1HPLC chromatograms of Suxiao Jiuxin Pill
2．4精密度、重复性及稳定性试验按上述色谱条件，取S1供试液连续进样6次测定精密度；配制S1供试液6份进样测定重复性；分别在S1样品供试液制备后0、5、10、15、20、24h进样测定稳定性。

以藁本内酯峰的保留时间和峰面积为参照，计算五波长下各指纹峰的相对保留时间RSD＜2．0%和相对峰面积的RSD＜5．0%。

结果表明精密度和重复性良好，样品在24h内稳定。

2．5系统指纹定量法和鉴定标准［7-8］系统指纹定量法是用宏定性相似度S m整体监测化学指纹数量和分布比例，用宏定量相似度P m整体监测化学指纹整体出峰数和峰高，用指纹均化性变异系数α绝对值限定指纹变异性。

用三者大小可定量鉴定中药质量，见表1。

表1中药质量级别鉴定标准Tab．1The criteria of TCM quality grades
参数
等级
12345678
S m≥0.950.900.850.800.700.600.50＜0.50 P m/%95 10590 11080 12075 12570 13060 14050 1500 ɕα≤0.050.100.150.200.300.400.50＞0.50质量极好很好好良好中一般次劣
2．6速效救心丸五波长HPLC指纹图谱建立将12批供试液进样分析并记录色谱图，见图2。

以藁本内酯为参照物，按峰出现率70%（S/N≥5）计，确定指纹峰为29（265nm）、31（276nm）、29（290nm）、27（300nm）和24（310nm）。

将290nm图谱积分AIA文件导入软件按均值法生成准对照指纹谱（PRFP）并评价12批样品，以S m和P m为指标进行聚类分析得S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S9、S10
877
图2在5个波长下12批速效救心丸HPLC指纹谱和其对照指纹谱
Fig．2HPLC fingerprints of12batches of Suxi-ao Jiuxin Pill and the RFPs under
five wavelength 和S12为第Ⅰ类，S8和S11为第Ⅱ类。

依据S m和P
m
接近，故选第I类10批样品按均值法生成五波
长下对照指纹谱（RFPs），再次评价各波长下速效救心丸质量见表2。

2．7用FW-HPLC-FP评价速效救心丸［9］在265、
276、290、300、310nm波长检测12批样品S
m
，P
m
和α见表2，分别以五个波长的对照指纹图谱作参照。

横向比较12批样品在任一波长检测到的化学成分数量、分布比例和指纹比例变异情况都较相似，但各成分含有量有显著差异导致质量级变化。

纵向比较同一样品在不同波长质量有显著差异，说明任何单波长指纹谱鉴定质量结果具有片面性，必须对不同波长结果进行合理整合。

2．8均值法（AM）和主成分整合法（PCI）评价速效救心丸将五波长下的S m，P m和α取均值重新评价12批速效救心丸见表2。

主成分分析是应用广泛的多元统计方法，用于简化数据，快速实现模式或关系的可视化识别［10］。

利用SPSS16.0分别以S m、
P
m
和α值与不同的波长组成矩阵进行主成分分析，以特征值大于1为提取标准，分别得到1、1、3个主成分，主成分的累计贡献率大于90%。

计算时将原始数据利用因子系数得分矩阵重新整合［11］得到新的S m、P m和α，再次评价速效救心丸质量级，其结果与均值法鉴定结果完全一致，相互验证。

AM和PCI 鉴定出S12（2级）质量很好；S3、S4、S6和S7（3级）质量好；S10（5级）质量中等；S1和S9（7级）质量次；S2、S5、S8和S11（8级）质量劣。

3讨论
速效救心丸中主要化学成分有生物碱类川芎嗪、有机酸类阿魏酸和内酯类藁本内酯等，在260 320nm附近有较强紫外吸收，任何单波长指纹谱无法对速效救心丸进行准确表征。

多波长指纹谱能实现指纹谱信息最大化，从DAD所记录190 400nm 色谱图中选取重点波长265、276、290、300、310nm 建立速效救心丸五波长谱可最大限度获取该制剂中复杂化学指纹定性定量全信息。

12批药物中一批整体指纹含有量过低，三批含有量过高。

本实验结果表明中国药典仅规定几个指标成分含有量下限做法显然不科学，其严重忽视因化学指纹含有量过高而导致的用药不安全问题。

977
表2基于FW-HPLC-FPs定量指纹谱评价12批速效救心丸质量
Tab．2The12batches of Suxiao Jiuxin Pill quality evaluated based on FW-HPLC-FPs
不同波长参数S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12 265nm S m0.930.910.950.940.940.900.950.650.930.910.660.79 P m61.0148．192．894.939.6102．781.2500.8131.0127．8431.5103．4
α0.010.020.000.000.030.060.020.100.020.170.090.07
等级672282386585 276nm S m0.920.820.960.940.950.940.950.610.870.970.610.95 P m57．8159.088．488．337．3101.177．6505．7134.2130.9423．8103．4
α0.060.020.050.040.020.110.040.110.030.080.130.02
等级783383486681 290nm S m0.920.780.940.940.940.930.910.580.810.960.570.91 P m52．3163．481.880.333．9100.575．6529.1146.1126.7435．6103．5
α0.060.070.070.080.040.160.060.100.070.100.150.01
等级783384487581 300nm S m0.940.940.960.950.950.950.960.570.850.980.570.94 P m50.5154.781.981.735．2113．081.2591.4156.4130.9502．7102．0
α0.160.130.040.070.090.140.020.110.060.040.120.09
等级783383388682 310nm S m0.960.970.970.960.960.960.980.580.940.980.580.98 P m47．6168．081.080.435．7119.984.8661.1156.2132．8565．293．1
α0.250.090.080.120.170.110.020.020.060.010.020.05
等级883383388682 Mean平均值法S m0.930.880.960.950.950.940.950.600.880.960.600.91 P m53．9158．685．285．136.4107．480.1557．6144.8129.8471.8101.0
α0.110.070.050.060.070.120.030.090.050.080.100.05
等级783383387582 PCI主成分整合法S m0.930.890.950.940.940.930.950.600.880.950.600.90 P m53．9158．685．285．136.4107．480.1557．6144.8129.8471.8101.0
α0.080.060.040.050.050.110.030.100.040.080.110.05
等级783383387582
参考文献：
［1］国家药典委员会．中华人民共和国卫生部药品标准：制剂第18册［S］．北京：人民卫生出版社，1998：295．
［2］李镤．速效救心丸及其新对药———川芎、冰片［J］．北京中医，2006，25（9）：575-576．
［3］董顺福，朱志国．速效救心丸中Ca，Mg，Fe，Cu，Zn的测定及Ca/Mg，Cu/Zn比值分析［J］．光谱学与光谱分析，2002，22
（3）：478-479.
［4］奚克生，董顺福，朱志国．氟离子选择性电极法测定速效救心丸中氟含量［J］．广东微量元素科学，1998，5（10）：
54-56．
［5］杨莉丽，王畅，张德强，等．中成药速效救心丸的红外光谱聚类分析研究［J］．光谱实验室，2010，27（5）：
2064-2068．［6］孙国祥，张静娴．基于三波长融合谱的系统指纹定量法鉴定龙胆泻肝丸真实质量［J］．色谱，2009，27（3）：318-322．［7］孙国祥，胡玥珊，毕开顺．系统指纹定量法评价牛黄解毒片质量［J］．药学学报，2009，44（4）：401-405．
［8］孙国祥，张静娴．系统指纹定量法鉴别龙胆泻肝丸质量［J］．分析化学研究简报，2009，37（8）：1183-1187．
［9］孙国祥，吴波，毕开顺．平行五波长高效液相色谱指纹图谱全息整合法定量鉴定杞菊地黄丸的整体质量［J］．色谱，
2010，28（9）：877-884.
［10］李效贤，熊耀康，余陈欣，等．高效液相色谱指纹图谱法分析南方红豆杉药材的氯仿提取物［J］．色谱，2010，28（11）：
1067-1070.
［11］陈随清，魏雅磊，王静，等．多指标成分分析确定山茱萸最佳采收期［J］．中国现代中药，2011，13（1）：29-33．
087。