1株湿地稀有放线菌的多相分类鉴定_唐树戈

菌株属于 Brevibacterium linens，相似性为 98.834%。
关键词：海洋放线菌；短杆菌属；多相分类；鉴定
DOI:10.3969/j.issn.1000-1700.2014.01.008
中 图 分 类 号 ：Q939.13.2
文献标识码： A
文 章 编 号 ：1000-1700(2014)01-0033-04
7%NaCl 的培养基中不生长，其最适 NaCl 浓度为 0%， 即为不喜盐菌。 菌株 S402003 的酸碱耐受性较强，在 pH 值为 5~12 条件下均可生长，在 pH 值为 1~4 或 pH
短杆菌属（Brevibacterium）最初由 BREED 于 1953 年发表，以菌株 Brevibacterium linens 为该属的模式菌株[1]。 短杆菌属是海洋放线菌目中的稀有菌属之一，到 2006 年为止，短杆菌属只有 15 株的菌株被分离鉴定。 由于其形态 呈棒状，且不产生基内菌丝和孢子，易与其他种属的放线菌菌株相区分的同时，也容易与细菌菌株相混淆[2]。 很多研 究者从不同的生态环境中分离到短杆菌属菌株， 比如 BHASKAR 等从 5904m 深海海泥中分离到 2 株短杆菌属菌 株[3]；WAUTERS 等从人血液及透析液中分离到 6 株短杆菌属菌株[4]。因此，从不同的生态环境中，对该属菌株进行发 掘并深入研究具有重要的现实意义。 本研究从鸭绿江滨海湿地海泥样品中，分离到 1 株稀有放线菌 S402003，通过 形态观察、培养特征、生理生化特征、化学组分鉴定以及 16S rRNA 基因序列分析对其进行多相分类鉴定。
Abstract： Strain S402003 was isolated from marine sediment collected from Yalu River in Dandong, Liaoning Province. Based on the polyphasic studies, including the morphology, physiological and biochemical characteristics, chemotaxonomy and 16S rRNA gene sequence analysis, the results showed that strain S402003 had lipase activity and was capable to reduce nitrate, belongs to the mild salt-tolerant and basophilic bacteria. It was primarily identified as Brevibacterium linens with the similarity 98.834%. Key words： marine actinomycete; Brevibacterium; polyphasic taxonomy; identify
Polyphasic Taxonomy of a Rare Marine Actinomycetes
TANG Shu-ge 1, ZHANG Liu 1,2, YU Ji-cheng2*, LIU Qiu2, QI Xiao-hui 2
(1. College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China; 2. College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian Liaoning 116600, China）
沈阳农业大学学报，2014－02，45(1)：33-36 Journal of Shenyang Agricultural University，2014－02，45(1)：33-36
1 株湿地稀有放线菌的多相分类鉴定
唐树戈 1，张 柳 1,2，于基成 2*，刘 秋 2，齐小辉 2
（1.沈阳农业大学 生物科学技术学院，沈阳 110161；2.大连民族学院 生命科学学院，辽宁 大连 116600）
取 5.0g 海泥样品于 45.0mL 无菌水中，摇匀后于 55℃水浴处理 6min。 梯度稀释后取 100μL 涂布于 M1 固
收稿日期： 2013-08-10 基金项目：国家自然科学基金项目(31270051, 31311140255) 作者简介： 唐树戈（1971-），女，沈阳农业大学副教授，博士，从事生物化学研究。 * 通讯作者 Corresponding
用胶回收试剂盒回收 PCR 产物，将其连接在载体 pMD18T 上，反应体系为 10μL（T-载体 1μL，PCR 回收产 物 4μL，连接缓冲液 5μL），于 16℃反应过夜后，于 4℃固定 30min。 全量反应液转化 E.coli 感受态细胞 JM109。 蓝 白 斑 筛 选 白 色 菌 落 ， 采 用 引 物 M13 -47 (5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA C -3’) 和 引 物 RV -M (5’ GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)扩增载体中插入的目的片段长度。 扩增产物进行测序分析[生工生物工程 (上海)股份有限公司]。 测序结果用 MEGA5.0 进行序列拼接，拼接结果提交到 EzTaxon Server version 2.1[11]数据库 获取与待测菌株相近菌株的 16S rRNA 基因序列， 将所得的序列用 CLUSTAL W [12] 进行同源性比对后， 采用 Neighbor-joining 法[13]构建其系统进化树。
identify短杆菌属渊brevibacterium冤最初由breed于1953年发表袁以菌株brevibacteriumlinens为该属的模式菌株短杆菌属是海洋放线菌目中的稀有菌属之一袁到2006年为止袁短杆菌属只有15株的菌株被分离鉴定遥由于其形态呈棒状袁且不产生基内菌丝和孢子袁易与其他种属的放线菌菌株相区分的同时袁也容易与细菌菌株相混淆很多研究者从不同的生态环境中分离到短杆菌属菌株袁比如bhaskar等从5904m深海海泥中分离到2株短杆菌属菌曰wauters等从人血液及透析液中分离到6株短杆菌属菌株遥因此袁从不同的生态环境中袁对该属菌株进行发掘并深入研究具有重要的现实意义遥本研究从鸭绿江滨海湿地海泥样品中袁分离到1株稀有放线菌s402003袁通过形态观察尧培养特征尧生理生化特征尧化学组分鉴定以及16srrna基因序列分析对其进行多相分类鉴定遥材料与方法11材料供试菌株s402003分离自鸭绿江滨海湿地滩涂海泥样品遥供试rtaqdna聚合酶尧pmd19t载体和ecoli感受态细胞jm109购自takara公司遥试验采用的分离培养基为m1培养基渊含50滋g窑ml1制霉菌素和25滋g窑ml1冤曰纯化培养基为改良isp5培养基渊酵母提取物5g尧l天门冬氨酸1g尧甘油10ml尧k1g尧微量盐5ml尧琼脂18g尧海水500ml尧去离子水500ml袁ph值7274冤遥微量盐配方为院feso水1l遥试验采用的主要仪器有院ct15rt高速冷冻离心机上海天美科学仪器有限公司尧ftc5h02pcr仪渊英国techne公司冤尧dyy6c电泳仪渊北京市六一仪器厂冤尧zhjhc1112c超净工作台尧mls3020高压灭菌锅渊日本三洋集团冤尧uvpgeldocittm310凝胶成像系统尧s4800扫描电子显微镜渊日本日立集团冤遥12方法取50g海泥样品于450ml无菌水中袁摇匀后于55益水浴处理6min遥梯度稀释后取100滋l涂布于m1体培养基上袁28益培养714d遥挑取单菌落于改良isp5培养基上划线纯化遥121形态特征观察采用硅片插片法袁在改良isp5固体培养基上划线培养7d后袁经戊二醛固定袁于扫描电子显微镜下观察菌株形态特征遥122培养特征观察将放线菌菌株s402003接种到高氏1号培养基尧改良isp5培养基尧hv培养基和海藻糖脯氨酸培养基上袁28益培养14d后袁观察菌落的培养特征遥123生理生化特征调查按照shirling
摘 要 ：从鸭绿江滨海湿地样品中分 离 得 到 1 株 稀 有 海 洋 放 线 菌 S402003，通 过 形 态 观 察 、培 养 特 征 、生 理 生 化 特 征 、化 学 组 分 鉴 定
以及 16S rRNA 基因序列分析对其进行多相分类鉴定。 结果表明：该菌株具有脂酶活性，能还原硝酸盐，属于轻度耐盐、嗜碱菌。 该
可分解吐温-20、吐温-40 和吐温-80，MR、V-P 试验呈阴性，可还原硝酸盐，不产生 H2S，牛奶凝固与胨化呈阴性。
第1期
唐树戈等：1 株湿地稀有放线菌的多相分类鉴定
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2.4 放线菌 S402003 的 NaCl、pH 值和温度耐受性 由图 2 可知，菌株 S402003 可耐受 6%NaCl，在含
Figure 1 Morphological characteristics of strain S402003 on modified ISP5 medium(×9000)
表 1 菌株 S402003 在不同培养基上的培养特征 Table 1 Cultural characteristics of strain S402003 on
1 材料与方法
1.1 材料 供试菌株 S402003 分离自鸭绿江滨海湿地滩涂海泥样品。供试 rTaq DNA 聚合酶、pMD19-T 载体和 E.coli 感受
态细胞 JM109 购自 TaKaRa 公司。 试验采用的分离培养基为 M1 培养基[5]（含 50μg·mL-1 制霉菌素和 25μg·mL-1 萘啶 酸[6]）；纯化培养基为改良 ISP5 培养基（酵母提取物 5g、L-天门冬氨酸 1g、甘油 10mL、K2HPO4 1g、KNO3 1g、微量盐 5mL、琼脂 18g、海水 500mL、去离子水 500mL，pH 值 7.2~7.4）。 微量盐配方为：FeSO4 1g、ZnSO4 1g、MgCl2 1g、超纯 水 1L。 试验采用的主要仪器有：CT15RT 高速冷冻离心机(上海天美科学仪器有限公司)、FTC5/H02PCR 仪（英国 TECHNE 公司）、DYY-6C 电泳仪（北京市六一仪器厂）、ZHJH-C1112C 超净工作台、MLS-3020 高压灭菌锅（日本 三洋集团）、UVP GelDoc-ItTM310 凝胶成像系统、S-4800 扫描电子显微镜（日本日立集团）。 1.2 方法
教授，博士，从事微生物资源及应用研究。
author：于基成（1968-），男，大连民族学院
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沈阳农业大学学报
第 45 卷
体培养基上，28℃培养 7~14d。 挑取单菌落于改良 ISP5 培养基上划线纯化。 1.2.1 形态特征观察 采用硅片插片法，在改良 ISP5 固体培养基上划线培养 7d 后，经戊二醛固定，于扫描电 子显微镜下观察菌株形态特征。 1.2.2 培养特征观察 将放线菌菌株 S402003 接种到高氏 1 号培养基[7]、改良 ISP5 培养基、HV 培养基和海藻 糖-脯氨酸培养基上[8]，28℃培养 14d 后，观察菌落的培养特征。 1.2.3 生理生化特征调查 按照 SHIRLING 和 GOTTLIEB 等的方法对菌株 S402003 的淀粉水解、硝酸盐还原、 脲酶及脂酶活性等生理生化特性进行测定 。 [6，9] 1.2.4 NaCl、pH 值和温度耐受试验 采用改良 ISP5 做为基础培养基，分别添加终浓度为 0%、0.5%、1%、2%、3%、 4%、5%、6%、7%的 NaCl，28℃培养 14d 后收集菌体，烘干称质量，考察菌株对 NaCl 的耐受性，试验设 3 次重复。 采 用改良 ISP5 做为 基础培养基 ，在不同 pH 值 （4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，13.0，14.0）下 ，28℃培 养 14d 后，观察菌落生长大小和数量，试验设 3 次重复。 采用高氏 1 号培养基，在不同温度（4，10，28，37，45℃）条 件下培养 30d，每 3d 观察菌落生长大小和数量，试验设 3 次重复。 1.2.5 细胞壁化学组分分析 参照王平[10]改进的薄层层析体系对菌株 S402003 全细胞水解液氨基酸以及全细 胞水解液糖型进行分析。 1.2.6 16S rRNA 基因序列分析 采用机械破碎法提取菌株 S402003 的总 DNA。 采用放线菌通用引物 1522R(5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)和 F27(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)扩增其 16S rRNA 序列。 反应条件 为：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，30 个循环；72℃ 5min。 PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
different media
培养基
菌Media
Color of the colony Soluble pigment Growth
改良 ISP5
黄棕 Brown
无 None 很好 Aboundant
Modified ISP5
高氏 1 号
白色 White
无 None
良好 Good
由表 1 可知，菌株 S402003 在改良 ISP5 培养基上生长状态最好，在高氏 1 号培养基和海藻糖-脯氨酸培养 基上生长适中，在 HV 培养基上生长较差。 可见，在培养基中添加丰富的氮源能够有效促进该菌株的生长。
S-4800 5.0KV 7.7mm×9.00K SE(M)
5.00μm
图 1 菌株 S402003 在改良 ISP5 培养基上的扫描电 镜 照 片 (×9000)
2 结果与分析
2.1 放线菌 S402003 的形态特征 菌株 S402003 在改良 ISP5 培养基上不产孢，不产生基内菌丝，菌落呈黄棕色，无可溶性色素产生。 培养 7d
后在扫描电镜下观察形态呈短杆状，单个，有时成对，常以 V 字形排列，无分支（图 1）。 2.2 放线菌 S402003 的培养特征
Gause's no.1 medium
海藻糖-脯氨酸
淡黄 Light yellow 无 None
良好 Good
T-p medium
HV
白色 White
无 None
较差 Little
2.3 放线菌 S402003 的生理生化特征 由表 2 可知，菌株 S402003 不产生黑色素，明胶液化呈阴性，不水解淀粉和纤维素，不产生吲哚，不利用尿素，