如何用Cas9做敲入

如何用Cas9做敲入
Cas9介导同源重组（HDR）除了需要多引入一条修复模板（repair template），基本操作和做基因敲除（KO）基本一致（Fig 1）。

顺利的情况下整套操作下来至少需要4周时间（心急吃不到热豆腐嘞~~），其中单克隆的获取和鉴定是最大的限速步骤。

WT的Cas9 （这里指spCas9）是引起双链断裂（DSB），进而引起NHEJ（nonhomologous end joining，意思就是断裂的末端重新连起来，这一过程容易产生indels）或者HDR（修复模板存在）；但有一个突变体（D10A）却只保留了切口酶的活性（nickase）（spCas9n），一般不会引起NHEJ，但会引起HDR（修复模板存在）。

大家周知WT的spCas9会有些微的脱靶效应，因此利用cas9n代替WT的cas9产生deletion（需要两条sgRNA同时作用）或者HDR可以降低一部分脱靶的效果（Fig. 2）。

Fig 1. Cas9敲除/敲入基因时间安排
Fig 2. Cas9 (D10A)突变体（Cas9n）只保留nickase活性
这一突变体不会引起NHJE。

如果同有两条sgRNA靶向一个gene的不同位点，Cas9n会引起一个片段（两个sgRNA之间）的deletion。

修复模板存在的情况下可以引起HDR。

今天的内容主要讲讲利用Cas9怎么做同源重组（修复）（HDR）。

其实基因的敲入（KI）也是一模一样的做法。

如何利用Cas9做同源重组
一、同源臂的设计
和做KO比较，做HDR最大的不同就是要有同源模板的存在。

同源模板有以下两种类型(Fig. 3):
1单链模板：手动设计单侧同源臂长度不低于40 nt，但强烈推荐设计~90 nt。

找引物合成公司合成较长单连oligo即可(90+90+Insertion)，针对正链或者反链合成都ok。

没有必要使用PAGE纯化。

为了验证方便，建议引入酶切位点（RFLP法）。

当然，同源模板也可以是线性化的双链DNA片段，可以通过线性化载体或者基因合成/PCR获得。

溶解成终浓度10 mM，-20°C分装保存。

2线性化双链模板：同源臂在1000 nt左右；线性化载体或者PCR产物作为转染模板。

二、转染
★12孔板：2 ✕105 cells/well (50-70% confluency)
★500 ng Cas9（或者Cas9n）-sgRNA
★1 μl单链同源模板（10 μM）
三、鉴定方法
通过GFP或者puromycin富集成mixture，然后直接PCR测序或者利用Restriction-
fragment length polymorphism (RFLP) 分析方法。

四、结论
1、WT的Cas9直接切割双链，引起DSB，重组效果最好，但会引起脱靶；
2、单链oligo作为模板优于线性化载体作为模板；
3、貌似反义oligo的模板效果优于正链。