马钱子碱经皮给药对乳腺癌种植瘤中VEGF和COX-2蛋白表达的影响

2012年
11月第36卷第6期
马钱子是马钱科植物马钱Strychnos．nux -vomi-ca L．或云南马钱Strychnos pierriana A．W．Hill 的干
燥成熟种子。

中医学认为马钱子辛温，有大毒，具有通络止痛、消肿散结之功效。

现代医学研究表明，马钱子碱（Brucine ）为其主要成分之一，具有抑制肿瘤生长、诱导癌细胞凋亡及增强机体免疫力等作用。

环氧合酶（COX ）是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，COX －2从多个环节参与肿瘤形成，包括抑制癌细胞凋亡、促进肿瘤血管生成、增加侵袭转移、抑制机体免疫功能等。

血管内皮生长因子（VEGF ），被认为是特异性内皮生长因子，能增加血管的渗透性和血管的生成。

研究表明，VEGF 和COX －2能促进肿瘤血管的生成［1］。

本研究用马钱子碱经皮给药作用于裸鼠乳腺癌种植瘤模型，检测各组肿瘤组织VEGF 和COX －2蛋白表达量，探讨其作用机制。

1材料
Balb /c －nu /nu 裸鼠，SPF 级，雌性，8～9周龄，17～23g ，由南京大学模式动物研究所提供，许可证
号：SCXK （苏）2010－0001。

马钱子碱，购自中国药品生物制品检定所，每瓶20mg ，批号0706－2005；人乳腺癌细胞株MDA －MB －231，购自上海中科院细胞库；VEGF （sc －7269），批号G3201，Stan Cruz ；COX －2（SC －1747），批号H3512，Stan Cruz ；通用型二步法二抗试剂盒（PV －6000），批号11158B26，北京中杉金桥；DAB 显色剂（ZLI －9032），批号11182A11，北京中杉金桥。

2方法
2．1乳腺癌种植瘤模型的复制和分组无菌条件
下，用2mL 注射器的针头，针尖于裸鼠左后肢刺入肌肉内，肌内注射0．2mL 细胞悬液（约1×107个细胞），复制20只乳腺癌种植瘤裸鼠模型。

以75％乙醇溶解马钱子碱（20mg /瓶），用凡士林配成乳膏，分别为20％（0．2mg /g ）、10％（0．1mg /g ）、5％（0．05mg /g ）三个浓度，马钱子碱经腹腔给药（intraperitoneal ，ip ）的半数致死量（LD50）为69mg ·kg 。

根据LD50的量，设高剂量组（A 组）、中剂量组（B 组）和低剂量组（C 组）。

接种之后的20只荷瘤裸鼠模型随机分为4组，实验高、中、低剂量组和模型组，每组5只，接种24h 后开始给药。

实验组（A 、B 、C 组）：分别给予上述配制的高、中、低浓度的马钱子碱膏，涂抹整个腹部
马钱子碱经皮给药对乳腺癌种植瘤中VEGF 和
COX -2蛋白表达的影响
徐媛媛1，夏克春2，张
梅1，李
平1
（1．安徽省立医院中医科，安徽合肥230022；2．安徽中医学院第二附属医院肿瘤科，安徽合肥230022）［摘要］目的：探讨马钱子碱经皮给药对乳腺癌种植瘤的抑制机制，为乳腺癌的治疗提供新的途径。

方法：培养人乳腺癌细胞株MDA －MB －231，取对数生长期细胞制成单细胞悬液。

20只雌性Balb /c －nu /nu 裸鼠麻醉后，无菌条件下，局部肌肉注射乳腺癌单细胞悬液0．2mL ，复制乳腺癌肿瘤模型。

20只荷瘤裸鼠随机分为4组：马钱子碱高剂量组（A 组）、中剂量组（B 组）、低剂量组（C 组）和模型组（D 组），分别给予20％、10％、5％浓度的马钱子碱膏（经腹腔给药，每日总剂量不超过LD50）和凡士林经皮给药，涂抹裸鼠的整个腹部和造模的部位，每次1g ，每日4次，连续15d 。

观察各组裸鼠生存状态和肿瘤生长情况，评价抑瘤率；检测肿瘤组织中血管内皮生长因子（VEGF ）和环氧合酶－2（COX －2）蛋白表达。

结果：①肿瘤大小和抑瘤率：A 组和B 组裸鼠生存状态良好，肿瘤引起的活动障碍较轻，肿瘤生长均受到不同程度的抑制，肿瘤生长较C 组和D 组迟缓，各组的抑瘤率分别为A 组53％、B 组45％、C 组27％（P ＜0．05）；而C 组和D 组裸鼠出现活动障碍、瘫痪、消瘦和精神萎靡，肿瘤体积较大。

②免疫组化结果：VEGF 和COX －2马钱子碱A 组分别为0．22±0．01和0．15±0．02，B 组分别为0．25±0．01和0．18±0．01，C 组分别为0．26±0．02和0．20±0．01，
D 组分别为0．42±0．02和0．35±0．03。

VEGF 和COX －2蛋白在肿瘤组织中表达的程度与模型组比较是随马钱子碱剂
量的增加而逐渐减弱，差异均有统计学意义（P ＜0．05）。

结论：马钱子碱经皮给药能抑制乳腺癌种植瘤中VEGF 和
COX －2的蛋白表达。

［关键词］乳腺肿瘤；马钱子碱；经皮给药；环氧合酶－2；血管内皮生长因子；裸鼠［中图分类号］R285．5
［文献标识码］A
［文章编号］1007－659X （2012）06－0529－03
［收稿日期］2012－04－28
［作者简介］徐媛媛（1981－），女，安徽合肥人，硕士，医师，研究方向为中医治疗肿瘤。

第36卷第6期
山东中医药大学学报
Vol．36，No．62012年11月JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY OF TCM
Nov .2012529
2012年11月山东中医药大学学报第36卷第6期
和接种部位的整条后肢，每次1g ，每日4次，连续15d ；模型组（D 组）：整个腹部和接种部位的整条下肢涂抹凡士林，每日5次，连续15d 。

2．2计算抑瘤率接种5周后颈椎脱臼处死裸鼠，无
菌操作下剥离肿瘤组织，游标卡尺测量肿瘤长短径，电子天平称瘤质量，计算出各组的肿瘤平均体积和瘤质量，比较各组的抑瘤率。

大部分组织置入10％甲醛浸泡，用作免疫组化检查。

肿瘤体积V ＝（a ×b 2）/2（a 为肿瘤长径，b 为肿瘤短径）［2］；抑瘤率＝（对照组瘤体积－实验组瘤体积）/对照组瘤体积×100％。

2．3免疫组化染色SP 法检测VEGF 和COX －2蛋白
表达量
石蜡切片（厚度4μm ）常规脱蜡至水化。

微
波修复：将切片浸入pH ＝8．0EDTA 抗原修复液微波炉加热至沸腾后断电，间隔5min 后，重复1次，冷却至室温。

PBS 洗3次各3min ；滴加3％H 2O 2，室温静置10min ；PBS 洗3次，各3min ；滴加正常山羊血清封闭液，室温30min ；滴加Ι抗（1∶200稀释）50μL /片，4℃过夜；4℃过夜后需在室温复温10min ；PBS 洗3次，每次5min ；滴加Ⅱ抗工作液50μL /片，37℃
30min ；PBS 洗3次，各5min ；滴加辣根酶标记链霉
卵白素工作液50μL ；PBS 洗3次，各5min ；DAB 显色5～10min ，在显微镜下掌握染色程度；自来水冲洗；苏木精复染1min ，盐酸乙醇分化数秒；自来水冲
洗10～15min ；梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、烤片、显微镜拍照。

结果判断采用计算机光密度分析，每张切片随机取5个视野，用平均光密度值表示VEGF 和COX －2的蛋白表达量。

2．4
数据统计分析所有数据采用x ±s 表示，组间
两两比较用q 检验，以P ＜0．05表示有显著性差异。

3
结果
3．1裸鼠乳腺癌种植瘤模型的建立复制20只裸
鼠乳腺癌种植瘤模型，全部成功，成瘤率100％，成瘤时间为接种乳腺癌细胞后10～15d ，实验期间没有裸鼠死亡。

3．2各组肿瘤生长情况和抑瘤率造模12d 后各
组裸鼠均见肿瘤生长，约黄豆大小。

15d 后肿瘤增长明显，体积逐渐增大，马钱子碱A 、B 组较D 组增长明显迟缓。

20d 后D 组和C 组裸鼠出现行动不便；
A 、
B 组裸鼠生存状态良好，肿瘤引起的活动障碍较轻。

至接种5周，处死裸鼠前，D 组裸鼠出现瘫痪、精
神不振、消瘦，各组无裸鼠死亡。

接种5周后，颈椎脱臼处死裸鼠，剥离肿瘤组织，计算各组平均肿瘤质量和体积，各组抑瘤率见表1。

种植瘤大小见图2。

与D 组比较，A 、B 组的瘤质量和瘤体积均有显著性差异（P ＜0．05），C 组有差别，但无统计学意义。

图2
马钱子碱处理组和模型组种植瘤大小比较
表1
马钱子碱对裸鼠种植瘤的抑制作用（n ＝5）
剂量（qm /mg ·d －1）
瘤质量（m /g ）
瘤体积（V /cm 3）
抑瘤率（％）
A 组0．83．21±0．22△△1．41±0．18△53
B 组0．43．54±0．18△△1．64±0．25△△45
C 组0．23．93±0．352．17±0．4927
D 组
－
4．65±0．32
2．99±0．71
与D 组比较△P ＜0．01，△△P ＜0．05
3．3免疫组化检测VEGF 和COX －2的蛋白表达量
免疫组化结果见表2，图3～6。

结果判断采用计算机光密度分析，每张切片随机取5个视野，用平均光密度值表示VEGF 和COX －2的蛋白表达量。

阳性
细胞为黄褐色颗粒着色，VEGF 和COX －2蛋白在肿瘤组织中表达的程度与D 组比较随马钱子碱剂量的增加而逐渐减弱，差异均有统计学意义（P ＜0．05）。

4讨论
COX 是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，包
括COX －1和COX －2两种亚型，COX －2从多个环节参
与肿瘤形成，包括抑制癌细胞凋亡、促进肿瘤血管生成、增加侵袭转移、抑制机体免疫功能等。

VEGF 被
认为是特异性内皮生长因子，能增加血管的渗透性和血管的生成，并且在软骨内成骨和长骨的构建方面起着多样的生物学功能。

VEGF 是目前所知道的最强的直接作用于血管内皮细胞的生长因子，在肿瘤生长过程中，VEGF 的产生导致血管形成加快，出现大量结构和功能异常的肿瘤血管，加速肿瘤的形
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成［3］。

研究表明，VEGF 和COX －2能促进肿瘤血管的
生成［1］。

研究结果证明，乳腺癌局部高表达COX －2可促进肿瘤细胞增殖，并通过上调VEGF 水平，促进肿瘤血管生成，并促进大鼠乳腺骨转移癌发生、发展［4］。

本实验运用免疫组化方法研究马钱子碱对乳腺癌种植瘤组织中VEGF 和COX －2蛋白表达的影响。

结果显示，与D 组相比，马钱子碱各剂量组VEGF 和COX －
2蛋白表达均有所降低，随着剂量增加，降低越明显，提示马钱子碱可能通过降低乳腺癌VEGF 和COX －2蛋白的表达水平，抑制肿瘤新生血管的生长，
从而抑制肿瘤生长，故降低VEGF 和COX －2蛋白表达可能是马钱子碱抑制乳腺癌种植瘤生长的机制之一。

［参考文献］
［1］Lavalle GE ，BertagnolliAC ，TavaresWL ，et al．COX －2expression
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究进展［J ］．医学综述，2010，19（10）：2938．
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骨移植瘤中的表达及意义［J ］．中国癌症杂志，2010，20（5）：348－
351．
图4
裸鼠乳腺癌种植瘤VEGF 的表达
图6裸鼠乳腺癌种植瘤COX -2
的表达
表2
不同剂量马钱子碱对VEGF 和COX －2蛋白表达影响
VEGF
COX －2A 组0．22±0．01△△0．15±0．02△△B 组0．25±0．01△0．18±0．01△C 组0．26±0．02△0．20±0．01D 组
0．42±0．02
0．35±0．03
与D 组比较△△P ＜0．01，△P ＜0．05
徐媛媛等：马钱子碱经皮给药对乳腺种植瘤中VEGF 和COX －2蛋白表达的影响
图3不同剂量马钱子碱对VEGF 蛋白表达影响
0．50．450．40．350．30．250．20．150．10．050
高剂量组中剂量组低剂量组模型组
高剂量组中剂量组低剂量组模型组
VEGF
图5不同剂量马钱子碱对COX -2蛋白表达影响
0．40．350．30．250．20．150．10．050
高剂量组中剂量组低剂量组模型组
中剂量组
高剂量组
低剂量组
模型组
COX －2
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