酵母降胆固醇药物筛选模型的建立与应用 (1)

文章编号:042727104(2005)0420490208
收稿日期:2005205206
基金项目:上海市经委高新技术产业科技开发资助项目,上海市科委重点科技资助项目(02ZD19146)
作者简介:谭永林(1979—
),男,硕士研究生;徐冬斌(1977—),男,硕士研究生.霍克克,kkhuo @.酵母降胆固醇药物筛选模型的建立与应用
谭永林,徐冬斌,张达力,施慧莉,陈家宽,霍克克
(复旦大学生命科学学院,上海　200433)
摘　要:根据酵母和人类在固醇代谢机制方面的高度保守性,通过构建不同的麦角固醇合成相关基因缺失菌株建立了一种新的基于酵母菌的降胆固醇药物筛选模型,并以作用机理明确的药物洛伐他汀和吉非罗其作为对照标准,探索了本模型对降胆固醇药物的筛选条件.进而利用本模型对临床报道有降胆固醇作用的传统中药:丹参、山楂以及成分明确、疗效显著的复方亚油酸胶囊和月见草油胶丸进行了筛选试验.结果验证了利用本模型筛选药物的可行性,并初步分析了上述药物可能的作用机理.
关键词:酵母;胆固醇;药物筛选
中图分类号:Q 819 文献标识码:A
酿酒酵母和人类在脂类代谢方面具有较高的保守性,两者的固醇合成途径也十分相似,区别仅在于242脱氢胆固醇在酵母内最终合成麦角固醇,而在人体内最终合成胆固醇.作为一种模式生物,酵母越来越广泛地被运用于人类疾病研究和药物筛选1～4.随着我国人民的生活水平逐年改善,高血脂、高胆固醇患者也日益增多.目前市场上的降血脂药物多数有比较严重的副作用,而许多具有很好降血脂、降胆固醇临床效果的传统中药却往往因有效成分不清,作用机理不明而不能被充分地利用.本文利用一系列固醇相关基因缺失的酵母菌株,建立了一种新的降胆固醇药物筛选模型,并以作用机制明确的洛伐他汀以及吉非罗齐作为对照,对传统降胆固醇中药材丹参、山楂和成分明确的复方亚油酸、月见草进行筛选试验.1　材料与方法:
1.1　实验菌株
(1)酿酒酵母(S accharom yces cerevisiae )固醇合成代谢基因正常的单倍体对照菌株:
H KY109:S288C (H )M A Ta ,ura 3252;H KYA105:(H )M A Ta ,his3,leu2,met15,ura3,
ΔYAL066W ;H KYA103:(H )M A Ta ,his3,leu2,met15,ura3,ΔYA L 068C.
(2)酿酒酵母固醇合成代谢基因缺失的单倍体菌株:
H KYA102256:(H )M A Ta ,his 3,leu2,met15,ura3,ΔY PL 069C ;H KYA104148:(H )M A Ta ,his3,leu2,met15,ura3,ΔY CR048W ;H KYXG 2d :(H )M A Ta ,his3,leu2,met15,ura3,ΔY PL 069C (B TS 1),ΔY GL 012W (ER G4).
(3)酿酒酵母固醇合成代谢基因缺失的二倍体菌株(以下均为本实验室保存):
以下菌株共同的基因型为(D )M A Ta ,his3/his3,leu2/leu2,met15/met15,ura3/ura3.不同的是H KYD1104571:ΔY GL 012W (ER G4)/ΔY GL 012W (ER G4);H KYD110511:ΔY M R015C (ER G5)/ΔY M R015C (ER G5);H KYD1106159:ΔYL R450W (HM G2)/ΔYL R450W (HM G2);H KYD1104061:ΔY PL 069C (B TS 1)/ΔY PL 069C (B TS 1);H KYD1107161:ΔY N R019W (A R E2)/ΔY N R019W (A R E2);H KYD1107809:ΔY CR048W (A R E1)/ΔY CR048W (A R E1).
第44卷　第4期2005年8月复旦学报(自然科学版)Journal of Fudan University (Natural Science )Vol.44No.4Aug.2005
1.2　药品试剂
Taq 聚合酶及Ex Taq 聚合酶购自申能博彩(上海)公司;DNA 分子Marker Hi n d Ⅲ和DL2000购自Ta KaRa 公司;Zymolyase (20,000u/g )购自日本Seikagaku 公司.
洛伐他汀(mevinolin )购自美国Sigma 公司,吉非罗齐(gemfibrozil )为上海三维制药公司生产,“贯通牌”多烯酸乙酯胶丸(武汉中联集团四药公司生产)、“万象牌”复方亚油酸乙酯胶丸(上海延安万象药业公司生产)和“星鲨牌”月见草油胶丸(厦门星鲨集团生产)均购自市售药房.北山楂(产地江苏)和丹参(产地安徽)均购于上海同仁堂药店.
酵母菌完全培养基YEPD :1.0%酵母抽提物,1.0%蛋白胨,2.0%葡萄糖.
酵母产孢活化培养基PSM :0.8%酵母抽提物,0.3%蛋白胨,10%葡萄糖,2%琼脂.
酵母产孢培养基SM :1%醋酸钾,0.1%酵母抽提物,0.05%葡萄糖,2%琼脂,补充0.002%Uracil ,0.002%Histidine 2HCl ,0.002%Methionine ,0.01%Leucine.
1.3　山楂粗提物的制备
参考文献5报道,取干山楂150g ,粉碎,加入150mL 无菌水,80℃水浴锅中热浸4h ,滤去药渣.滤液经真空浓缩,冷冻干燥,得到山楂的水溶性干燥固体粉剂.
1.4　丹参粗提物的制备
参考文献报道5,6,取干丹参150g ,粉碎,使用150mL 的75%乙醇中热浸,煎煮4h ,滤去药渣.滤液经真空浓缩,冷冻干燥,得到丹参酒精溶性粉状抽提物.
1.5　酵母菌接合生孢与四分子分离
参照文献7进行.
表1　用于检验各基因剔除菌株的PCR 引物Tab.1　Primers for detecting the gene 2disrupted yeast strains 引物名称引物序列K anMX 2A 5’2CTCACCG A GGCA GTTCAATA GG ATG 23’YG L012W 2A 5’2TGCTG A G AACATCG AA G AAA GGCTA 23’YG L012W 2S 5’2GTAAATCA GGGCTCGTTTCTTCTCG 23’YMR015C 2A 5’2TATCATCTACCGCTGTCATGCTCGCC 23’YMR015C 2S 5’2CAAACCTGCGTCTATATGCTGCCG 23’Y L R450W 2A 5’2A GGCAATAAATTA GGCA GCACCTCCG A 23’Y L R450W 2S 5’2CTAAATCTCCTCAA GCACCTACC 23’YPL069C 2S 5’2CTTCCA GCATA GCA G AAATTACGTG 23’YPL069C 2A 5’2ATCTTCA GCATCTTTA G A GCACGG A 23’YNR019W 2S
5’2CTATAA G A GGGG ACG AA G ATTA GCCGC 23’YNR019W 2A 5’2GG A GGGCAATAA GTA GTGTTTCGGGG 23’YCR048W 2S 5’2TTGG ACTCATTTA GCG AACAATA GCACC 23’
YCR048W 2A 5’2TATA G ACCTACG A GCACTTTGCCCCTG 23’ 注:KanM X 2A 为kanMX 基因序列中的反向引物,A 为被剔除基因序列 的反向引物,S 为其序列的正向引物.
1.6　基因剔除菌株的检验
参考前人方法8,设计各被剔除基
因的上、下游特异性引物P1和P2,以及
报告基因kanMX 的引物P3(见表1).提
取酵母菌株总DNA 为模板,分别利用
引物P1/P2,P1/P3进行PCR 反应.根
据PCR 产物的大小判断目的基因是否
被准确剔除.
1.7　药物筛选
各菌株分别于5mL 液体YEPD 培
养基30℃培养12h.测定菌液浓度并稀释至OD 600=0.1～0.2.按照下图分别接种4～6μL 合适浓度的菌液至含有待
筛选药物的培养平板、只含有药物溶剂和不含任何药物的培养平板.以固醇代谢基因正常的菌株S288C 、与固醇代谢无关基因突变的菌株H KYA105和H KYA103作为对照菌株.其中H 为单倍体,D 为双倍体菌株.每个实验均设3个平行对照组,每块平板点种顺序从上到下为:3→2→1,7→6→5→4,11→10→9→8,13→12(1.H KYD1107809;2.H KYD1107161;3.H KYD1106159;4.H KYA105;
5.H KY109;
6.H KYA103;
7.H KYXG 2d ;
8.H KYD1107161;
9.H KYD110511;10.H KYD1106159;11.H KYD1104061;12.H KYD110511;13.H KYD1104061).
1.8　药物溶解与筛选平板的制备
称取3g 固体丹参抽提物溶于相应5mL 无菌水,于50℃水浴锅内保温振荡1h ,完全溶解后分装保存.称取2g 山楂抽提物溶于5mL 乙醇.于50℃水浴锅内保温振荡1h ,完全溶解后分装保存.
取复方亚油酸乙酯胶囊内容物1mL ,加入无水乙醇,定容至5mL.55℃水浴锅保温1h ,每10min 振荡1次,分装,保存.取月见草油胶丸内容物0.5mL ,溶于5mL 无水乙醇,55℃水浴锅保温1h ,每10min
1
94　第4期谭永林等:酵母降胆固醇药物筛选模型的建立与应用
图1　HKY D1107809菌株中YCR 048W 基因缺失验证Fig.1　Verification of the
YCR 048W gene 2disrupted
strain HKY D1107809by PCR
1.以YCR048W 2S ,YCR048W 2A 为引物检测HKY D1107809;
2.DL2000Marker ;
3.以YCR048W 2S 和KanM X 2A 为引物检测HKY D1107809;
4.以YCR048W 2S ,YCR048W 2A 为引物检测HKY109
振荡1次,得均匀悬浮乳液.分装,保存.取10mg 洛伐他汀加0.2mL 无水乙
醇在55℃溶解,再加入0.1mL ,0.6mol/L 的氢氧化钠,保温30min ,加无菌
水,定容至2.5mL ,分装,保存.取吉非罗齐胶囊内容物100mg ,55℃溶于1
mL 乙醇,离心取上清,分装,保存.配制药物筛选平板时取所需用量的药物与
预先经60℃融化的20mL 固体YEPD 培养基混合均匀,倒入平板.
1.9　筛选结果观察
试验平板在30℃恒温培养箱倒置培养,分别在第12,24和48h 观察各
组平板上菌落的生长状况,并对结果拍照保存.
2　结　果
2.1　基因剔除菌株的验证
(1)对于本模型用的所有酵母相关基因缺失菌株都要事先经过PCR 验证,根据PCR 产物的大小确定相关基因是否已被KanMX 基因所完全替换剔除.如图1所示.
(2)双基因突变单倍体菌株的构建
将酵母固醇代谢相关单基因突变的酵母双倍体菌株经产孢培养基培养,
显微解剖分离单孢子,培养获得不同接合型的单倍体菌株.用不同单基因突
变的单倍体菌株经过酵母菌接合、产孢和显微解剖分离单孢子(图2,图3).
经PCR 鉴定从中选到有双基因突变的单倍体菌株(图4).图4　HKYXG 2d 菌株中双基因缺失的PCR 验证Fig.4　Verification of the double gene 2disrupted strain HKYXG 2d by PCR 1.DL2000Marker ;2.以YPL069C 2S 和YPL069C 2A 为引物;3.以YPL069C 2S 和K anMX 2A 为引物;4.以YG L012W 2S 和YG L012W 2A 为引物;5.以YG L012W 2S 和Kan MX 2A 为引物
2.2　药物筛选实验
(1)对洛伐他汀筛选实验　以降胆固醇作用机理明确的药物洛
伐他汀为筛选对象,建立本筛药模型的标准数据.经过对洛伐他汀
一系列浓度的测试,结果发现当洛伐他汀浓度为40μg/mL YEPD ,
在30℃培养24h ,它与对照平板相比具有最明显的生长抑制差异.
所有菌株在对照平板上的生长情况正常,而7号的H KYXG 2d 菌株
和11,13号的H KYD1104061菌株在含药平板上的的生长被明显
抑制(图5).
(2)对吉非罗齐的筛选实验　以降胆固醇作用机理明确的药物
吉非罗其为筛选对象,建立本筛药模型的标准数据.经过对吉非罗
其一系列浓度的测试,结果发现当吉非罗其浓度为250μg/mL
YEPD ,在30℃培养24h ,它与对照平板相比具有最明显的生长抑
制差异.所有菌株在对照平板上的生长情况正常,而9,12号的
H KYD11051菌株在含药平板上的生长被明显抑制(图6).
(3)对复方亚油酸的筛选实验　以具有临床降胆固醇作用的市
售药物复方亚油酸胶囊为筛选对象,建立本筛药模型的实验数据.经
过对复方亚油酸一系列浓度的测试,结果发现当洛伐他汀浓度为30294 复旦学报(自然科学版)第44卷　
mg/mL YEPD ,在30℃培养24h ,它与对照平板相比具有最明显的生长抑制差异.所有菌株在对照平板上的生长情况正常,而7号HKYXG 2d 和11,13号HKY D1104061菌株在含药平板上的生长被明显抑制(图7)
.
图5　对洛伐他汀的筛选实验
Fig.5　Screen test for
mevinolin
图6　对吉非罗其的筛选实验
Fig.6　Screen test for
gemfibrozil
图7　对复方亚油酸的筛选实验
Fig.7　Screen test for compound ethyl linoleate
(4)对月见草油的筛选实验　以具有临床降胆固醇作用的市售药物月见草油胶丸为筛选对象,建立本筛药模型的实验数据.经过对月见草油一系列浓度的测试,结果发现当月见草油浓度为10mg/mL YEPD ,在30℃培养24h ,它与对照平板相比具有最明显的生长抑制差异.所有菌株在对照平板上的生长情况正常,而9号、12号H KYD110511菌株在含药平板上的生长被明显抑制(图8)
.
图8　对月见草油的筛选实验
Fig.8　Screen test for Oenothera biennis oil
394　第4期谭永林等:酵母降胆固醇药物筛选模型的建立与应用
(5)对丹参抽提物的筛选实验　以具有临床降胆固醇作用的传统中药丹参为筛选对象,建立本筛药模型的实验数据.经过对丹参提取物一系列浓度的测试,结果发现当丹参的乙醇提取物浓度为25mg/mL YEPD ,在30℃培养24h ,它与对照平板相比具有最明显的生长抑制差异.所有菌株在对照平板上的生长情况正常,而9、12号H KYD110511和7号H KYXG 2d 菌株在含药平板上的生长被明显抑制(图9)
.
图9　对丹参提取物的筛选实验
Fig.9　Screen test for Salvia miltiorrhiza extract
(6)对山楂抽提物的筛选实验　以具有临床降胆固醇作用的传统中药山楂为筛选对象,建立本筛药模型的实验数据.经过对山楂提取物一系列浓度的测试,结果发现当山楂的水提取物浓度为15mg/mL YEPD ,在30℃培养24h ,它与对照平板相比具有最明显的生长抑制差异.所有菌株在对照平板上的生长情况正常,而7号H KYXG 2d 和11号、13号H KYD1104061菌株在含药平板上的生长被明显抑制(图10)
.
图10　对山楂提取物的筛选实验
Fig.10　Screen test for haw
3　讨　论
3.1　洛伐他汀抑制YPL069C 基因缺失菌株HK YXG 2d 、HK YD1104061的机理分析
酵母YPL069C 基因编码GGPP 合成酶,促进焦磷酸异戊酸转化为焦磷酸法呢酯,是麦角固醇合成相关的25个基因中唯一的与类萜(terpenoid )合成相关的基因10.在麦角固醇合成途径中,HM G 2CoA 通过HM G 2CoA 还原酶合成甲羟戊酸,再生成焦磷酸异戊酸,在YPL069C 编码的GGPP 合成酶的作用下,最终生成GGPP ,作为供体为细胞膜蛋白提供疏水基团.在YPL069C 缺失情况下,酵母细胞仍然可以生长,说明焦磷酸异戊酸可以通过其他旁路途径合成GGPP ,维持基本生长.洛伐他汀可竞争性抑止HM G 2CoA 还原酶活性9,降低甲羟戊酸量,低水平的甲羟戊酸可以维持一定量焦磷酸法呢酯的合成,进行后续反应.而GGPP 的最后合成必须经过YPL069C 基因的作用,当洛伐他汀作用于YPL069C 基因缺失菌株时,本已较低水平的GGPP 无法维持细胞正常生活所需,最终导致酵母菌株死亡.
实验中通过杂交分孢子获得了YPL069C 和YG L012W 双缺失的菌株H KYXG 2d ,表明麦角固醇合成和类萜合成这两条途径可以同时被阻断.在YPL069C 缺失之后,酵母细胞通过替代途径维持基本生长.而YG L012W (编码C 224(28)固醇降解酶,促进ergosta 25,7,22,24(28)2trienol 转化为麦角固醇11)是麦角固醇合成途径中的最后一个基因.GGPP 的合成,依赖于麦角固醇合成途径中ergosta 25,7,22,24(28)2trienol 之前的产物,而不是麦角固醇,YG L012w 的缺失对于GGPP 的合成不会产生重要影响.
494 复旦学报(自然科学版)第44卷　
综上所述,我们推测在YPL069C 缺失时,固醇合成途径中从HM G 2CoA 到ergosta 25,7,22,242tetraen 23β2trienol 之间的旁路途径可能对于细胞生长至关重要,如果被阻断,菌株就无法生长.这条作用途径对于筛选降胆固醇药物非常重要.
3.2　吉非罗其抑制YMR 015C 基因缺失菌株HK YD110511的机理分析
吉非罗齐是有效的降血脂药,可以显著提高血浆高密度脂蛋白(HDL ),降低血浆甘油三酯(TG )和胆固醇12.有研究表明吉非罗其增加固醇和胆酸分泌到胆汁中,提高过氧化物酶体β氧化作用和HM G 2CoA 还原酶活性.吉非罗其可使HM G 2CoA 还原酶活性增加16.7倍.由于过氧化物酶体β氧化作用增强而增加的乙酰辅酶A 主要是转到固醇合成途径,很少转到磷酯蛋白合成途径13.YMR015C 编码麦角固醇合成途径中的Cy450酶14,促进ergosta 25,7,24(28)2trienol 转化为ergosta 25,7,22,24(28)2trienol.它并不是酵母生长的必需基因.YMR015C 的突变会导致代谢途径中前一步起作用的ER G3基因表达上升,ER G3编码固醇C 25去饱和酶,协助上游固醇代谢产物转化为ergosta 25,7,24(28)2trienol.有研究证实,通过试验方法,无法得到ER G11单一突变菌株,但是当ER G3和ER G11同时突变时,菌体可以生长.原因是ER G11突变产生一种有毒性物质142methyl 2ergosta 28,24(28)2dien 23,62diol ,该物质是因为后续产物不能完全被ER G3编码的酶蛋白去饱和而形成的.当ER G3也突变时,细胞丧失去饱和活性,该毒性物质也就无法形成.根据以上分析,吉非罗其抑制YMR015C 缺失菌株,可能的机制是:YMR015C 缺失导致ER G3活性提高,在吉非罗其作用下固醇合成水平又大幅增加,造成大量的ER G3反应产物不能转化为麦角固醇而过量累积,最终对细胞产生毒性,影响细胞生长.
3.3　复方亚油酸和山楂抑制缺陷型菌株生长机制分析
复方亚油酸中的主要成分是亚油酸乙酯和橙皮甙.多烯酸类药物可以促进胆固醇向胆酸的转化;促进胆固醇代谢、转运.共轭亚油酸是过氧化物酶体增殖活化受体的配位体和催化剂,可明显增加肉毒碱棕构酰基转移酶活性,从而促进胆固醇代谢16;另一方面,它可以降低脂蛋白脂酶活性,减少游离脂肪酸进入脂肪组织17.山楂主要含有三萜类和黄酮类化合物,其中熊果酸和金丝桃苷具有显著抗氧化,明显降低超氧自由基对血管内皮的损伤,降低TCH ,升高HDL/TCH 的作用18.我们的实验结果表明,复方亚油酸和山楂水抽提物对于YPL069C 与H KYXG 2d 基因缺失菌株同时存在抑制,其表现与洛伐他汀的抑制效果完全一致.因此我们认为,山楂抽提物与复方亚油酸可能会抑制焦磷酸异戊酸的最终生成,导致合成GGPP 的减少,同时,YPL069C 基因的缺失,可能造成了GGPP 产物的减少,菌株死亡.
3.4　月见草抑制缺陷型菌株生长机制分析
月见草(Oenothera biennis )主要产于中国东北,主要作用成分是γ2亚麻酸.在人体内γ2亚麻酸可转化
为花生四烯酸(AA )或二高2γ2亚麻酸(D G LA ),进而转化为前列腺素(P Gs )和白三烯(L T ).据报道,月见草
油可以降低总胆固醇(TC ),提高高密度脂蛋白(HDL )19.在本药物筛选模型中,月见草油表现为特异性抑制YMR015C 基因缺失菌株的生长.它的抑制效果与吉非罗其一致.因此我们分析,月见草油可能具有与吉非罗其相似的作用机制.
3.5　丹参抑制缺陷型菌株生长机制分析
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge )的活性成分主要为脂溶性的二萜醌类化合物,丹参酮I ,丹参酮IIA ,IIB ,紫丹参素等,以及水溶性的酚酸类化合物,包括原二茶酚和丹参素等.但是不同产地的丹参中有效成分存在差异20.目前对于丹参对细胞内作用机制的研究较少.本文的实验结果表明,丹参水抽提物可以抑制YMR015C 单基因缺失和YPL069C/YG L012W 双基因缺失菌株的生长.但丹参对于YG L012W 单基因缺失菌株以及YPL069C 单基因缺失菌株没有明显的抑制作用.YG L012W 基因编码C 224(28)固醇降解酶,催化麦角固醇合成,并由此运至膜内.该基因缺失会导致ergosta 25,7,22,24(28)2tetraen 23β2trienol 在体内的大量的累积.因此我们分析丹参可能的作用机制是促进固醇合成中异戊烯醇焦磷酸到ergosta 25,7,22,24,(28)2trienol 的中间物的合成.当YG L012W 基因缺失后,中间产物虽然会发生累积,但可能不如YMR015C 缺失导致的影响严重,所以细胞仍然可以存活.当YPL069C 缺失后,会通过其他途径补充GGPP ,但GGPP 合成量可能低于正常水平.GGPP 水平的降低,影响了膜疏水蛋白的合成,可能导致渗透压变化,丹参更容易发挥其促进固醇合成的作用,促进ergosta 25,7,22,24,(28)2trienol 的生成.YG L012W
5
94　第4期谭永林等:酵母降胆固醇药物筛选模型的建立与应用
基因的缺失,导致无法进行后续作用,产物大量累积,导致细胞不能生长.
本文利用系列酿酒酵母麦角固醇代谢相关基因缺失菌株初步建立了一种新的筛选降胆固醇药物的模型,并通过实验验证了该模型用于筛选降胆固醇药物的可行性.为今后的高通量、大规模筛选降胆固醇药物并探索我国传统中药的作用机理奠定了基础.与其他药物筛选模型相比,本模型具有容易操作,结果可靠,便于观察,同时可以实现大样本量的筛选和一药多筛的特点.
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694 复旦学报(自然科学版)第44卷　
The Development of Lipid2low ering Drug Screen Mode B ased
on Saccharomyces Cerevisiae
T AN Y ong2lin,X U Dong2bin,ZH ANG Da2li,SHI Hui2li,CHE N Jia2kuan,H UO Ke2ke
(School of L if e Sciences,Fudan U niversity,S hanghai200433,China)
Abstract:Both S accharomyces cerevisiae and Homo sapiens are same in most part of sterol biosynthesis pathway except Desmosterol become ergosterol in S.cerevisiae and the counterpart in human is ing the gene2disrupted S. cerevisiae strains,we combined different deletions by yeast sporulation,mating and tetrad dissection,and the growth status of the deletion strains growing in drug2containing medium were tested using mevinolin and gemfibrozil as the positive con2 trol drugs.C ompound ethyl linoleate,Oenothera biennis oil and some Chinese traditional medicine such as haw and Salvia miltiorrhiza Bunge were tested by this drug screen model.The results of the work were analyzed and discussed.
K eyw ords:saccharomyces cerevisiae;cholesterol;drug screening 794
　第4期谭永林等:酵母降胆固醇药物筛选模型的建立与应用 。