羟基自由基氧化体系对乳清蛋白、β-乳球蛋白化学结构的影响

羟基自由基氧化体系对乳清蛋白、β-乳球蛋白化学结构的
影响
孙妍，孔保华*，刘骞
【摘要】本实验主要研究乳清蛋白(WPI)和β-乳球蛋白(β-Lg)经过FeCl3/抗坏血酸(AsA)/H2O2产生的羟基自由基氧化系统氧化后化学结构产生的变化。

两种蛋白分别经过0.1mmol/L或者1mmol/L FeCl3氧化1、5和12h后，总巯基、游离氨都下降，而羰基、二聚酪氨酸和疏水性都呈增加的趋势。

低Fe3+浓度氧化1h，WPI巯基含量降低38.5%，β-Lg降低11.6%；而游离氨分别降低20.68%和0.64%。

高Fe3+浓度氧化5h，WPI羰基增加32.4%，β-Lg增加8.4%；二聚酪氨酸分别增加132.4%和28%；疏水值增加161.1%和0.7%。

高Fe3+浓度带来的氧化效果要比低Fe3+浓度明显(p＜0.05)。

这说明，氧化改变了蛋白的化学结构，氧化程度取决于浓度Fe3+的浓度，且β-乳球蛋白比乳清蛋白有更好的稳定性。

【期刊名称】食品科学
【年(卷),期】2009(030)011
【总页数】5
【关键词】蛋白氧化；乳清蛋白；β-乳球蛋白；羟基自由基；化学结构
氧化是食品加工贮藏期间引起食品品质下降的主要原因，目前越来越受到人们的重视。

氧化会引起乳品变味、变色、营养成分破坏，并且会产生有毒化合物[1-2]。

这些物理化学性质的改变和蛋白质的氧化有关，但是氧化的机理以及对整个食品质量安全体系的影响还不清楚。

最近有关氧化诱导肌原纤维蛋白化学结构改变以及对功能性影响的研究表明，氧化降低肌球蛋白结构的稳定性，增
加羰基含量，同时还引起肌球蛋白重链交联，导致肌原纤维蛋白凝胶能力的降低[3-5]。

二硫键和二聚酪氨酸的形成表明由羟基自由基引发的氧化可以使蛋白质发生聚合。

羟基自由基引起的蛋白损伤和蛋白水解的敏感性之间有直接的定量关系[6]。

乳清蛋白(WPI)和β-乳球蛋白(β-Lg)做为乳蛋白中的重要成分，是引起乳蛋白氧化的主要原因。

Liu等[3-4,7]研究发现，肌球蛋白、β-Lg和7S 球蛋白无论是分开还是结合使用都对氧化剂很敏感，氧化促进了肌球蛋白与β-Lg，肌球蛋白与7S球蛋白之间的交联。

本实验采用FeCl3/Asc/H2O2产生的羟基自由基氧化体系对乳清蛋白和β-Lg进行氧化，通过测定总巯基、疏水性、羰基、二聚酪氨酸和游离氨的含量，探讨氧化对蛋白内部结构产生的影响。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
乳清分离蛋白(WPI) 美国Daviso 食品公司。

氯化铁(FeCl3)、已二胺四乙酸(EDTA)、过氧化氢(H2O2)、抗坏血酸(AsA) 、邻苯二甲醛(OPA)、三氯乙酸(TCA)均为分析纯天津市东丽区天大化学试剂厂；丁羟基茴香醚(BHA)、Trolox(VE衍生物)、5,5’-二硫代二硝基苯甲酸盐(DTNB)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、8-苯氨基-萘酚-磺酸(ANS)、β-巯基乙醇、十二烷基磺酸钠(SDS) Sigma公司。

1.2 仪器与设备
F-4500荧光分光光度计日本日立公司；AL-104型精密电子天平、DELTA 320 pH计瑞士梅特勒-托利多有限公司；JJ-1型精密增力电动搅拌器常州国华电器有限公司；UV-1800紫外可见光分光光度计北京普析仪器公司；LGJ-25冷冻干燥机上海医用科学仪器厂；labscale TFF超滤系统美国Millipore公司；
DK-98-1型电热恒温水浴锅天津泰斯特仪器有限公司；ALLEGRA-64R冷冻离心机美国Beckman公司。

1.3 方法
1.3.1 β-Lg的提取
β-Lg参照Mate和Krochta方法[8]，从WPI中提取。

15%WPI(W/W)用2mol/L的HCl调到pH 2.0然后加入7%的NaCl(W/V)保持20min，于10000×g离心20min取上清液，用2mol/L NaOH调到pH7.0，最后用10000 NMWL( nominal molecular weight limit)的膜反复进行超滤得到的浓缩滤液冻干成粉。

1.3.2 羟基自由基产生氧化体系的制备
该系统可以产生活性氧自由基(reactive o xygen species，ROS)，为羟基自由基(·OH)产生氧化系统(hydroxyl radical-generating system，简称为HRGS)，主要由FeCl3、AsA和H2O2通过铁的氧化还原反应而产生。

其中H2O2为1mmol/L，AsA为0.1mmol/L；FeCl3分别为0.1 mmol/L和1 mmol/L。

整个氧化过程是在20 mmol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲溶液中进行的。

1.3.3 乳清蛋白的氧化反应
首先，在80℃时将WPI和提取的β-Lg预热30min，待其冷却到20℃后加入到不同FeCl3浓度的氧化体系中分别氧化1、5、12h，使最终蛋白的浓度达到20mg/ml。

通过添加BHA/Trolox/EDTA(使其最终浓度为1 mmol/L) 来终止氧化反应。

为了减少氧化试剂对测定指标的影响，氧化产物要经过20 mmol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液洗涤并于10000×g离心5min，得到的沉淀经过冻干处
理得到需要的氧化蛋白。

1.3.4 羰基含量的测定
羰基含量的测定按照Levine[9]的方法。

取1ml 2mg/ml的蛋白溶液放入塑料离心管中，每管中加入1ml 10mmol/L的DNPH，室温下静置1 h(每15 min 旋涡振荡一次)，添加1ml 20%TCA，然后10000×g离心5min，弃上清液，用1ml乙酸乙酯:乙醇(1:1)溶液洗沉淀3次(目的是除去没反应的DNPH试剂)，加3ml 6mol/L盐酸胍溶液，37℃条件下保温15min溶解沉淀，10000×g条件下离心3min除去不溶物质，最后获得物在波长370nm处测其吸光度。

对照组开始时只加入1ml 2mol/L HCl其余操作相同。

使用分子吸光系数22000/M·cm计算羰基含量，单位是nmol/mg；蛋白含量用Biuret法测定(注：离心和弃上清液前静置10min)。

1.3.5 巯基含量的测定
总巯基基团含量的测定参考Simplicio等[10]使用DTNB的方法进行测定。

取0.5ml浓度为20mg/ml的WPI溶液加入到4ml Tris-甘氨酸溶液(pH 8，每升该溶液中含有10.4g Tris、6.9g甘氨酸、1.2g EDTA、8mol/L尿素)中，上述的4.5ml样品再和0.5ml 10mmol/L DTNB试剂反应，30min后利用UV分光光度计在412nm处测定吸光度，巯基浓度计算使用摩尔消光系数13600/M·cm，被溶解的蛋白含量使用Biuret法测定。

对照组不加蛋白溶液，其他完全一样。

1.3.6 表面疏水性的测定
表面疏水性的测定是参考Kato等[11]描述的方法。

分别精确称取0.1g WPI和0.1g β-Lg，利用0.1mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解，定容在100ml的容
量瓶中，经均质机均质，取15ml 在10000×g条件下离心15min，除去不溶性氮，与此同时采用Biuret法测定上清液中的蛋白含量。

然后上清液用0.1mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释，使溶液中蛋白浓度控制在每毫升0.01～0.1mg蛋白，向每个被稀释的10ml溶液中加入600μl的ANS溶液(8mmol/L，利用0.1mol/L pH7的磷酸盐缓冲液配制)。

使用1cm 样品池，利用F4500荧光分光光度计测量。

激发波长390nm，发射波长470nm，狭缝宽选择10nm，在室温20℃下测定。

最终表面疏水值用初始斜率除以蛋白含量来表示。

1.3.7 二聚酪氨酸含量的测定
二聚酪氨酸含量的测定参考Davies等[12]描述的方法。

精确称取10mg 的WPI样品溶解在10ml pH 6.0的高离子强度的磷酸盐缓冲液中(浓度为20mmol/L，且该溶液中含有浓度为0.6mol/L的KCl)。

溶液经过滤纸过滤除去不溶性物质，被溶解的蛋白浓度通过Biuret法测定。

二聚酪氨酸含量利用荧光分光光度计测定，激发波长选择325nm，发射波长选择420nm，狭缝宽度均为10nm。

最终的二聚酪氨酸含量利用所测定的吸光度除以蛋白浓度获得，为相对荧光值。

1.3.8 游离氨的测定
采用OPA法对蛋白中游离氨基进行测定，参照管军军[13]的方法并进行改进。

准确称取40 mg的OPA溶解于1ml的甲醇中，分别加入质量分数20%的SDS 2.5 ml，0.1mol/L的硼砂25ml及100μl β-巯基乙醇，最后用重蒸水定容到50ml。

测定时，各取空白液、OPA试剂4ml于试管中，分别注入200μl(20mg/ml蛋白溶液)样品液，混匀后于35℃反应2 min，在340nm下
测其吸光度A340nm，二者之差ΔA340nm为自由氨基的净吸光度。

以未氧化的蛋白中自由氨基含量为100%，其余氧化蛋白的吸光度与未氧化蛋白中的自由氨基吸光度相比所占百分比为游离氨的相对含量，利用相对含量进行作图。

1.3.9 统计分析方法
本实验所列数据至少为3个试样的平均值。

数据采用Statistix8.1(分析软件，St Paul，MN) 软件包中Linear Mo dels程序进行，差异显著性(p＜0.05)分析使用Tukey HSD程序。

绘图软件采用SigmaPlot9.0。

2 结果与分析
2.1 氧化对羰基含量的影响
羰基的形成是蛋白氧化的显著标志，蛋白羰基可能是通过氧化攻击蛋白质侧链或肽键产生，在侧链上带有NH-或NH2-的氨基酸对羟基自由基非常敏感，这些基团在氧化的条件下形成羰基[14-15]。

WPI羰基含量如图1所示，羟基自由基氧化系统下蛋白羰基增加明显(p＜0.05)。

在低Fe3+浓度和高Fe3+浓度氧化体系中，羰基含量都随着氧化时间的增加而增加。

在同样的氧化时间内，高Fe3+浓度氧化后羰基含量要高于低Fe3+浓度。

氧化12h，低Fe3+浓度羰基含量和高Fe3+浓度差异不显著(p＞0.05)。

它们相对于未氧化的提高了将近33%。

本实验得到的结果和Liu等[3-4]得到的趋势一致，但羰基的含量不一样，其增长倍数要高于本实验，究其原因是因为本实验的氧化条件要弱于Liu等[3-4]的氧化条件，而且二者的氧化温度也不一样，另外实验原料也不同。

β-Lg氧化1h羰基含量没有增加反而降低，这和其他实验的结论不太一致[3-4]。

原因可能是本实验相对于Liu[3-4]氧化条件不同，H2O2和AsA的浓度都低于它们，并且氧化时间短，因此激发出的活性氧自由基较少，还不足以引发氨基
酸侧链上的某些氨基酸残基转变成羰基衍生物。

而一旦氧化时间延长，氧化条件充分时，活性氧自由基就可能会开始发挥作用。

2.2 氧化对蛋白巯基含量的影响
巯基转变成二硫键或者其他物质，这是自由基引发的蛋白氧化过程中最早发现的变化之一[16]。

如图2所示，同未氧化的WPI相比，高浓度Fe3+和低浓度Fe3+氧化后活性巯基都发生显著的降低(p＜0.05)。

最初未氧化蛋白的巯基含量是23.53μmol/g，而氧化1h后WPI的巯基急剧下降，达到了14.89μmol/g，巯基损失达36.7%多。

氧化5h的WPI相对于氧化1h的略微降低，但差异不显著(p＞0.05)。

高浓度Fe3+氧化体系中，氧化1h和氧化5h 的WPI的巯基含量分别为12.66、11.21μmol/g，差异不显著(p＞0.05)；低浓度Fe3+氧化1h和氧化5h的WPI的活性巯基含量分别为14.89、13.98μmol/g，二者差异不显著(p＞0.05)。

而氧化12h的WPI和氧化5h的WPI相比，低浓度Fe3+的下降要高于高浓度Fe3+，分别为17.1%和5.1%。

可以推测，高浓度Fe3+氧化浓度已经趋于全部氧化。

另外随着浓度Fe3+浓度的增加，巯基的含量总体上也是在逐渐降低的，高浓度Fe3+氧化体系的巯基含量都低于低浓度Fe3+的含量。

同WPI氧化趋势一样，β-Lg巯基降低趋势也较明显(p＜0.05)。

特别是高浓度Fe3+，随氧化时间的延长而逐渐降低。

而低Fe3+浓度氧化后总巯基下降差异不显著(p＞0.05)，反而有增加的趋势。

β-Lg含有5个半胱氨酸残基，可在66与160、119与121或106与119残基之间形成2个分子内二硫键，1个游离巯基[17]。

巯基减少的原因可能是巯基在氧化后以二硫键的形式存在。

而WPI巯基的减少程度要大于β-Lg，原因可能是在天然的β-Lg分子中，游离巯
基被埋藏在蛋白疏水基团的内部，因此不易于受到氧化的攻击[18]。

结果表明，蛋白氧化导致了巯基的降低，高浓度Fe3+氧化条件下巯基损失要多于低浓度Fe3+。

引发这一现象的原因可能是，高浓度FeCl3通过抗坏血酸驱动氧化还原循环反应会比低浓度Fe3+产生更多的Fe2+，也就会产生更多的蛋白-Fe2+复合物，随之而来产生更多的活性氧自由基，所以巯基含量会降低得更多。

2.3 氧化对疏水性的影响
如图3所示，相对于未氧化的乳清蛋白来说，疏水性都有所提高。

特别是高浓度Fe3+氧化体系，疏水性增加了近2倍。

低Fe3+浓度在氧化1h后表面疏水值增加不显著(p＞0.05)，而氧化5h后表面疏水值就显著增加(p＜0.05)，氧化12h更是如此。

低Fe3+浓度表面疏水值呈线性增长，数值增加明显(p＜0.05)；而高Fe3+浓度氧化后数值增长不显著(p＞0.05)，可见高Fe3+已经接近氧化结束。

两种Fe3+浓度在氧化12h后表面疏水值都达到接近的程度(p＞0.05)。

β-Lg经过氧化后表面疏水值差异不显著(p＞0.05)，呈现出较平缓的趋势。

表面疏水值是指在极性水溶液中蛋白表面的疏水基团的多少。

疏水性值是蛋白促进分子间交联能力的一个指标[19]。

在研究中发现，所有氧化后的蛋白其表面疏水性均有显著的增加(p＜0.05)，因而降低蛋白质的交联能力，这与Morzel等[6]的结论是一致的。

这可能是因为，在天然蛋白质中蛋白是以折叠的形式存在的，一些疏水性氨基酸侧链基团被包裹在蛋白质的结构内部，而氧化能使这些疏水性氨基酸从蛋白分子内部暴露到极性的溶液中，促进蛋白质解折叠的发生，从而导致表面疏水值的增加[6,20]。

2.4 氧化对二聚酪氨酸的影响
二聚酪氨酸的形成是羟基自由基引起蛋白氧化的一个很好的标志[12]。

如图4所示，氧化后蛋白的二聚酪氨酸含量都高于对照，而且高Fe3+浓度的数值要明显高于低Fe3+浓度氧化后的数值，这个趋势与Morzel等[6]的研究结果是一致的。

Mor z el[6]发现，当F e3+浓度从0.5mmol/L提高到1mmol/L时，二聚酪氨酸的含量有明显的增加。

而本实验中，高Fe3+浓度二聚酪氨酸的含量要明显高于低Fe3+浓度的值(p＜0.05)。

低Fe3+浓度在氧化后二聚酪氨酸含量呈线性增加的趋势，而高Fe3+浓度在氧化1、5h是增加的趋势，12h却呈降低的结果。

可能是酪氨酸聚合体发生分解的原因。

β-Lg氧化后二聚酪氨酸的含量要明显高于对照(p＜0.05)，只是随氧化时间的延长有所降低，但总体看还是高Fe3+浓度的含量高于低Fe3+浓度。

氧化1h，两者二聚酪氨酸含量变化不明显(p＞0.05)。

而氧化5h和12h二聚酪氨酸的含量相对1h却显著降低(p＜0.05)。

二聚酪氨酸之所以增加是因为活性氧自由基和其他氧化试剂引起蛋白氧化，通过共价和非共价作用形成蛋白质聚合物。

氨基酸残基侧链易受自由基攻击，和邻近的来自其他蛋白的活性氨基酸残基产生共价交联，其中就包括两个酪氨酸残基之间的络合作用，因此生成了二聚酪氨酸[21-22]。

至于二聚酪氨酸降低的情况可能是生成二聚酪氨酸后，分子内又发生重排的缘故。

2.5 氧化对游离氨的影响
赖氨酸残基对羟基自由基是很敏感的，它在蛋白的表面，在氧化的过程中，赖氨酸残基上的ε-NH2受到羟基自由基攻击，依靠脱氨反应很容易地就会转变成羰基[9]。

因此，游离氨的含量是降低的趋势。

如图5所示，游离氨的变化是随氧化时间延长而降低的。

未氧化的WPI看做100%，氧化后游离氨都在降低，
但降低的幅度不大。

高Fe3+浓度氧化5h和氧化12h游离氨的含量差别不大(p＞0.05)，这个结论和Liu等[3-4]是一致的。

另外，β-Lg对于低Fe3+浓度游离氨变化不明显(p＞0.05)，随氧化时间延长游离氨含量几乎未发生改变。

但是高Fe3+浓度氧化后游离氨含量还是有所降低的，只是变化幅度不如羰基变化大，原因可能是羰基的增加并非是氨基酸侧链直接氧化一条途径，还有其他的可能，比如肽骨架的断裂、还原糖反应等途径，因此游离氨含量的变化虽然跟羰基变化相关，但并不是线性关系。

3 结论
通过FeCl3/AsA/H2O2产生的羟基自由基氧化体系能够引起乳清蛋白和β-乳球蛋白的氧化。

氧化后蛋白的巯基、游离氨含量降低；羰基、二聚酪氨酸含量增加；疏水性提高，从而使蛋白的结构发生改变，并且这些指标之间有相关性。

而氧化程度的强弱在同样的抗坏血酸和H2O2浓度下与FeCl3的浓度有关，并且发现1mmol/L Fe3+浓度引发的氧化程度要高于0.1 mmol/L Fe3+时的程度。

通过对乳清蛋白和β-乳球蛋白氧化的比较研究表明，经过羟基自由基氧化体系氧化后，β-乳球蛋白比乳清蛋白有更好的稳定性。

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基金项目：国家自然科学基金项目(30871818)；黑龙江省自然科学基金重点项目(ZJN0605-01)
*通讯作者：孔保华(1963-)，女，教授，博士，研究方向为食品科学。

E-mail：kongbh63@。