猪圆环病毒1型贵州分离株全基因组的克隆与序列分析

猪圆环病毒1型贵州分离株全基因组的克隆与序列分析
王伟丞;梁海英;曾智勇;汤德元;刘钊
【摘要】为了解猪圆环病毒（PCV）在贵州的分子流行病学和遗传变异情况，同
时为其深入研究提供参考，应用PCR方法对采自贵阳、都匀和遵义地区疑似断奶
仔猪多系统衰竭综合征的病料进行 PCV1全基因组的扩增、克隆和测序分析。

结
果表明：扩增克隆的4株PCV1基因组全长均为1759 bp，4株PCV1间的核苷
酸序列相似性在99．1％～99．7％，与国内外其他PCV1参考毒株的核苷酸序列相似性均在98．1％以上，与参考毒株PCV2的核苷酸序列相似性在77％左右；
4株PCV1与国内其他PCV1毒株位于同一进化分支， PCV1国外毒株则位于另
一进化分支。

4株PCV1和参考毒株 PCV2的 ORF1、ORF2推导氨基酸序列相似性分别为86．2％～87．8％和64．0％～68．2％，4株PCV1与PCV2的
ORF1在复制起始区和其他功能区高度保守，可为构建嵌合病毒PCV1-2提供骨架。

%The amplification,cloning and sequence of PCV 1 complete genome
of four weaned pigs from Guiyang,Duyun and Zunyi infected with multi-systemic wasting syndrome were analyzed by PCR to study molecular epidemiology and genetic variation of PCV in Guizhou and to provide a reference for its further research.Total genome length of four PCV1 strains
is 1759bp and the similarity of nucleotide sequence between four PCV1 strains is 99.1%~99.7%.The similarity of nucleotide sequence is above 98.1% and 77% compared with PCV1 and PCV2 reference strains in GenBank respectively.Four PCV1 strains and other PCV1 strains in china belong to
the same evolution branch but foreign PCV1 strains belong to the other evolution branch.The similarity of amino acid sequence of four PCV1
strains is 86.2%~87.8% and 64.0%~68.2% compared with amino acid sequence deduced from ORF1 and ORF2 of PCV2 respectively.The ORF1 of four PCV1 strains and PCV2 in the origin of replication and other functional domain is highly conserved,which can provide a framework for structure of mosaic virus.
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2014(000)009
【总页数】3页(P161-163)
【关键词】猪圆环病毒1型;基因组;克隆;序列分析
【作者】王伟丞;梁海英;曾智勇;汤德元;刘钊
【作者单位】贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025;贵州大学教学实验场，贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属圆环病毒科圆环病毒属，为目前已知的最小动物病毒之一。

根据其致病性、抗原性以及核苷酸序列可分为PCV1和PCV2 2种基因型。

PCV1最早于猪肾细胞系PK-15中发现，一般认为其没有致病性，但其广泛存在于猪体内及猪源代细胞系[1]。

PCV2于断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)患病猪体内分离获得，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，此外与猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道综合征、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎等有关[2]。

PCV1
和PCV2具有相似的基因组结构，其基因组均由单股负链环状DNA组成，PCV1
大小为1 759 bp，PCV2为1 767 bp或1 768 bp，两者都含有2个主要的开放阅读框ORF1和ORF2，位于基因组相反的方向，其中ORF1基因编码与复制有
关的Rep蛋白，ORF2编码病毒结构蛋白[3]。

由于PCV1无致病性，而PCV2可引起PMWS，因此对PCV的研究以PCV2为主，对PCV1的研究较少。

然而，大量临床资料显示，PCV1在猪群中感染比较普遍，且PCV1感染能使猪体产生血清抗体[4]，因此不能排除PCV1对免疫系统可能造成损伤，以及在猪体内与PCV2
之间可能存在某种关系。

为了解猪圆环病毒在贵州的分子流行病学和遗传变异情况，同时为其深入研究提供参考，从近年贵州各地区送检的疑似患有PMWS的病猪组织中扩增克隆了4株PCV1，并对其基因组进行了序列测定和比较分析。

1.1 病料及试剂
病料样品系贵阳、都匀、遵义3个地区的4份PCV1阳性病料。

试剂主要有DNA 提取试剂盒，购自上海生物工程技术有限公司；LATaq DNA聚合酶、限制性内切酶SacⅡ、DL 2000、pMD19-TSimple Vector，均购自大连宝生物公司；
E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit，为OMEGA公司产品；普通质粒小提试剂盒，为TIANGEN公司产品；大肠杆菌感受态TOP10，为贵州省动物疫病研究室制备和
保存；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 引物的设计与合成
根据GenBank中发表的PCV1全基因序列，应用Primer Premier 6.0软件设计
克隆引物，PCV1-F：5’-CCCAAGCTTCTTTTTTGTTATCACATCGTAATG-3’；PCV1-R：5’-GGTGGATCCACTCAGTAATTTATTTTATATGGG-3’。

分别在引
物两端引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点(划线部分)，预期扩增大小为1 759 bp。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 病毒DNA的提取
取送检病死仔猪淋巴结、肾脏、脾脏等组织用PBS按1∶5倍稀释研磨，制成乳悬液，-80℃反复冻融3次后，8 000 r/min离心15 min，取上清用DNA提取试提剂盒取病毒核酸，-20℃保存备用。

1.4 PCV1全基因组的克隆与测序
利用设计的PCR引物，以制备好的DNA为模板进行PCR扩增。

PCR反应体系：模版DNA5.0 μL，10×LATaq Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 8.0 μL，上下游引
物各1 μL，LA Taq 0.5 μL，ddH2O 29.5 μL。

反应条件：94℃预变性5 min；94℃热变性1 min，57℃退火40 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃延伸10 min。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

将4个目的基因片段按照常规方法分别克隆到pMD19-T Simple载体中，进行PCR、酶切和测序鉴定。

1.5 序列分析
为了更好地了解不同地区PCV1毒株的遗传学特性及相互的亲缘关系，应用DNAStar7.0生物学软件，对克隆的PCV1全基因组序列与GenBank中查得的
15株PCV1及4株PCV2全基因组核苷酸序列进行比对分析，并绘制系统进化树；同时对4株PCV1贵州分离株与其他PCV1、PCV2参考毒株间的ORF1和ORF2推导氨基酸序列进行分析。

2.1 PCR扩增产物
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，引物扩增片段大小与预期结果一致，无非
特异性条带(图1)。

2.2 PCV1全基因组的克隆与全长
将PCR1产物回收纯化后克隆到pMD19-T Simple载体，对筛选出的阳性重组质粒进行序列测定。

4株PCV1基因组全长均为1 759 bp，GenBank登录号分别为GZ-GY1(KC878437)、GZ-GY2(KC894933)、GZ-DY1(KC924758)和GZ-
ZY1(KF732857)。

2.3 序列比对
经比对，19株PCV1的核苷酸序列相似性在98.1%～100%，4株PCV1贵州分离株的相似性为99.1%～99.7%，与国内PCV1毒株的相似性均在99.0%以上，而与国外PCV1毒株相似性在98.1%～99.0%，表明国内外PCV1毒株之间变异不大，比较保守，与Cortey M等[5]的研究结果一致。

19株PCV1与4株PCV2间的核苷酸序列相似性仅在77%左右，表明PCV1与PCV2核苷酸差异较大。

从图2看出，PCV1与PCV2分属于2个大的进化分支，其中4株PCV1与国内其他PCV1毒株均位于同一进化分支，而国外PCV1毒株则位于另一进化分支，表明国内PCV1毒株与国外PCV1毒株存在一定的变异。

2.4 PCV1与PCV2主要开放阅读框的推导氨基酸序列
经氨基酸序列分析表明，4株PCV1贵州分离株与其他15株PCV1的ORF1推导氨基酸序列相似性为97.8%～100%，与4株PCV2的相似性为86.2%～87.8%。

4株PCV1贵州分离株与其他15株PCV1的ORF2推导氨基酸序列相似性为94.1%～99.6%，与4株PCV2的相似性为64.0%～68.2%。

表明，PCV1与PCV2的ORF1的氨基酸相似性明显高于其ORF2，但在ORF2的N-末端的核定位序列、N-糖基化位点以及络氨酸磷酸化位点几个功能区却非常保守，与朱玲等[6]的研究结果一致。

目前，PCV2已成为危害世界养猪业的一种主要传染病，对其研究相对较深入，而对PCV1的研究较少。

Krakowka S等[7]用体外细胞传代的PCV1和PPV混合感染1日龄的新生仔猪，其中1头仔猪出现长达2周的PPV病毒血症，结肠拌有肉芽肿性的淋巴结炎。

在很多疑似PMWS的临床样品中，笔者多次检测出PCV1病毒的存在，因此不能完全排除PCV1的潜在致病性，且Baylis S A等[8]在人的疫苗里检测出PCV1，因此对于PCV1的相关研究很有必要。

从贵州贵阳、都匀、遵
义等地区送检的疑似PMWS病料中扩增克隆出4株PCV1全基因组，大小均为1 759 bp，其间基因组核苷酸序列的相似性在99%以上，与国内外其他PCV1毒株间的相似性在98.1%～100%，在系统进化分析树上中国PCV1分离株与国外分离株分别位于不同的进化分支，表明PCV1基因组总体上比较保守，但随地理分布
也有一定变异。

PCV1与PCV2的Rep蛋白抗原存在交叉，而Cap蛋白则不存在抗原交叉[9]。

PCV1与PCV2基因组结构的相似性，导致两者间部分ORF可以互换，从而构建
嵌合病毒，一种是将PCV2的ORF2置换PCV1的ORF2，构建嵌合病毒PCV1-2，另一种是以PCV1的ORF2置换PCV2的ORF2，构建嵌合病毒PCV2-1，前者能拯救出对猪有致病的病毒，但其毒力减弱，而后者无法获得具有致病性的病毒[10-11]。

将构建的嵌合病毒PCV1-2作为疫苗免疫动物后，不仅能够诱导实验猪产生较强的免疫应答，且能产生针对PCV2的Cap蛋白特异性抗体，并保留PCV1的
非致病性[12]，在PCV的新型疫苗研制中具有较大的潜力和应用价值。

4株PCV1和PCV2两者间的ORF1和ORF2对应的氨基酸序列相似性分别为86.2%～87.8%和64.0%～68.2%，即PCV1与PCV2的ORF1的氨基酸相似明显高于其ORF2，且4株PCV1与PCV2的ORF1在复制起始区和其他功能区高度保守，可为构建
嵌合病毒PCV1-2提供骨架。

本研究成功扩增克隆了4株PCV1全基因组，为下
一步构建PCV贵州分离株的嵌合病毒株及其免疫性等相关研究奠定了基础。

*通讯作者：曾智勇(1978-)，男，教授，博士，硕士生导师，从事动物传染病病原分子生物学研究。

E-mail:*****************.cn
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