教案血清IgG的分离与鉴定-长沙医学院
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多媒体
操作演示
多媒体
操作演示+示教片
时间配
1
20
5
15
20
5
60
复习思考及作业题布
1、常用的分离、纯化免疫球蛋白的方法有哪几种？
2、五类免疫球蛋白分离纯化的方法相同吗？
授课的创新点：
参考资料（包括辅助教材、参考书、文献等）：
教研室意见：
教研室主任签章：年 月 日
课后记（即通过收集教学督导专家、同行和学生的反馈信息，认真整理分析成功的经验和不足之处，在课程结束后填写）
（二）电荷效应
不同蛋白质pI不同，在相同pH值下所带电荷不同，因此在相同电场强度作用下，在电场中的移动（泳动）速度不同，可以根据这一效应把蛋白质分成不同的区带。
（三）分子筛效应
所聚合形成的PAG为多孔网状结构，对大分子物质的穿透有一定阻力，蛋白质在通过具有均一孔径的凝胶时，因颗粒大小不同，形状规则程度不同，所受阻力也不相同。利用本效应也可以将蛋白质分离为不同的区带。
2、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内(4℃)保存。可贮存1~2月。测定pH值(4.9~5.2)可检查其是否失效。失效液不能聚合。
3、TEMED要密封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，以防止氧化失效。
4、配胶取样要准确，最后加过硫酸铵，加完后轻轻混合（关键）；
5、配好胶后应于尽快灌胶（不要形成气泡），5分钟内完成装柱，清洗仪器；
教案
2012~2013学年第1学期
课程名称生物化学实验
开课系部基础医学系
开课教研室生物技术
授课教师赵娟
职称助教
授课班级2010级生物技术
学生人数28
长沙医学院教务处制
长沙医学院教案
课程名称
生物化学实验
授课题目（章节或主题）
血清IgG的分离与鉴定
授课教师
赵娟
所属系（部）
基础医学系
所属教研室
生物技术
职称
颗粒大形状不规则的分子→阻力↑→电泳v↓
颗粒小,球形分子→阻力↓→电泳v↑
将血清脂蛋白用苏丹黑B丙二醇预染，加于聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳具有浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，因此它的分辨率高，可将血清脂蛋白各组分清晰分开。
材料、试剂和仪器
1．蛋白提取液
2．聚丙烯酰胺溶液、SDS、过硫酸铵、TEMED
2.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的原理和方法
重点与难点：
重点：血清IgG的粗提原理；聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的原理
难点：血清IgG的粗提原理；聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的原理
教学方法（请打√选择）：
讲授法□讨论法□启发式□自学辅导法□练习法(习题或操作) 读书指导法□ＰＢＬ（以问题为中心的教学法）□其他□
6、切记装柱后立即用蒸馏水封闭；灌胶和电泳时要注意排除气泡；
7、加样时注意不能损伤已聚合的凝胶表面；
8、电泳时凝胶管不能漏水,并且与电泳槽垂直；凝胶和滤纸请放入垃圾桶中，勿直接倒入水池
9、电泳时间不能过久，待第一条色带到达玻璃管下端约2cm时停止电泳，否则色带会变宽。
此列为提示栏（包括重点、难点、教学方法、教学手段、更新教学内容、教书育人等）
教学手段（请打√选择）：
板书 实物□标本□挂图□模型□投影□幻灯 录像□CAI（计算机辅助教学）□
教学过程设计和教学内容：多媒体教学，讲授法、启发式提问法
教学内容：
牛血清IgG的提取
原理
从血清纯化抗体的方法很多，本实验将采用辛酸沉淀非免疫球蛋白和硫酸胺沉淀免疫球蛋白两个步骤，从血清中纯化多克隆IgG抗体。辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀腹水或血清中的非Ig蛋白；当加入33%-45%饱和硫酸胺时，IgG可被沉淀。
3.仪器：聚丙烯酰胺凝胶电泳系统、凝胶成像系统
实验步骤
、第1步改为：将清洁的0.5×7.5cm玻璃管（1支/2人），一端套上带有玻璃珠的橡皮管（同时滴入2滴蔗糖并检查有无漏水）垂直插在小试管上，以备制胶。从冰箱中取出下列试剂，在室温中平衡，然后在一小烧杯中依此加入。
2、第2步：迅速用吸管吸取上述混合液沿管柱注入玻管中，每管0.8ml-1.0ml，随即用滴管经针头沿管壁缓慢加入蒸馏水约0.5cm高度以隔氧；改为迅速用吸管吸取上述混合液沿管壁柱注入玻管中至离管口1cm，加满蒸馏水以隔氧。
材料、试剂、仪器
1.实验材料：牛血清
试剂：辛酸、硫酸铵
仪器：离心机
实验步骤：
1)准确量取牛血清5mL于500mL烧杯中，加入60mmol/L pH5.0醋酸缓冲液10mL，用盐酸溶液调pH4.5。
2)以每毫升稀释液加入50µL正辛酸的比例，在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温搅拌30min，4℃，5000r/min离心30min，弃去沉淀。
3)上清液4℃预冷，以1mL上清液加0.227g硫酸铵的比例，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温下继续搅拌30min，5000r/min离心30min。
4)将沉淀溶于20mL生理盐水中，透析过夜，离心去沉淀，上清液即为粗提IgG。
聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳检测
原理
一、实验原理
（一）浓缩效应
在pH=6.7的浓缩胶中带电粒子的泳动速度为: Cl- >protein>Gly，蛋白质样品夹在Cl-和Gly之间被挤压成一条狭窄的区带,使蛋白质样品浓缩。
4、第4步，电流为2～5mA/管，待第一色带到达胶管下段约1cm时停止电泳；改为电流为6mA/管，待第一色带到达胶管下段约2cm时停止电泳。
三、注意事项
1、丙烯酰胺和甲叉双丙烯胺是神经性毒剂，过硫酸铵为有毒成份，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触（漏胶时不要用手接触）。大量操作时应在通风橱中进行。
助教
授课时间
2012年12月1日第15周星期六第1-12节第10次课
授课时数
12学时
授课班级
生物技术专业（本科 专科□）2010级1班
教学课型
理论课□实验课 见习课□习题课□讨论课□其它□
教材名称、作者、出版社及出版时间
《基础生物化学实验》，高等教育出版社，魏群，2009
教学目的要求：
1.掌握血清IgG的粗提原理和方法
3、第3步然后取预染血清50μl加在凝胶面上，再沿管壁缓慢加入电泳液直至管的顶端，改为沿管壁缓慢加入电泳液直至管的顶端，用200μl枪取预染血清50μl加在凝胶面上；删除取血清0.2ml，加苏丹黑B丙二醇液0.02ml，加25%蔗糖溶液0.02ml，混匀，室温放置45min后, 2000r/min离心5min。
操作演示
多媒体
操作演示+示教片
时间配
1
20
5
15
20
5
60
复习思考及作业题布
1、常用的分离、纯化免疫球蛋白的方法有哪几种？
2、五类免疫球蛋白分离纯化的方法相同吗？
授课的创新点：
参考资料（包括辅助教材、参考书、文献等）：
教研室意见：
教研室主任签章：年 月 日
课后记（即通过收集教学督导专家、同行和学生的反馈信息，认真整理分析成功的经验和不足之处，在课程结束后填写）
（二）电荷效应
不同蛋白质pI不同，在相同pH值下所带电荷不同，因此在相同电场强度作用下，在电场中的移动（泳动）速度不同，可以根据这一效应把蛋白质分成不同的区带。
（三）分子筛效应
所聚合形成的PAG为多孔网状结构，对大分子物质的穿透有一定阻力，蛋白质在通过具有均一孔径的凝胶时，因颗粒大小不同，形状规则程度不同，所受阻力也不相同。利用本效应也可以将蛋白质分离为不同的区带。
2、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内(4℃)保存。可贮存1~2月。测定pH值(4.9~5.2)可检查其是否失效。失效液不能聚合。
3、TEMED要密封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，以防止氧化失效。
4、配胶取样要准确，最后加过硫酸铵，加完后轻轻混合（关键）；
5、配好胶后应于尽快灌胶（不要形成气泡），5分钟内完成装柱，清洗仪器；
教案
2012~2013学年第1学期
课程名称生物化学实验
开课系部基础医学系
开课教研室生物技术
授课教师赵娟
职称助教
授课班级2010级生物技术
学生人数28
长沙医学院教务处制
长沙医学院教案
课程名称
生物化学实验
授课题目（章节或主题）
血清IgG的分离与鉴定
授课教师
赵娟
所属系（部）
基础医学系
所属教研室
生物技术
职称
颗粒大形状不规则的分子→阻力↑→电泳v↓
颗粒小,球形分子→阻力↓→电泳v↑
将血清脂蛋白用苏丹黑B丙二醇预染，加于聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳具有浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，因此它的分辨率高，可将血清脂蛋白各组分清晰分开。
材料、试剂和仪器
1．蛋白提取液
2．聚丙烯酰胺溶液、SDS、过硫酸铵、TEMED
2.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的原理和方法
重点与难点：
重点：血清IgG的粗提原理；聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的原理
难点：血清IgG的粗提原理；聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的原理
教学方法（请打√选择）：
讲授法□讨论法□启发式□自学辅导法□练习法(习题或操作) 读书指导法□ＰＢＬ（以问题为中心的教学法）□其他□
6、切记装柱后立即用蒸馏水封闭；灌胶和电泳时要注意排除气泡；
7、加样时注意不能损伤已聚合的凝胶表面；
8、电泳时凝胶管不能漏水,并且与电泳槽垂直；凝胶和滤纸请放入垃圾桶中，勿直接倒入水池
9、电泳时间不能过久，待第一条色带到达玻璃管下端约2cm时停止电泳，否则色带会变宽。
此列为提示栏（包括重点、难点、教学方法、教学手段、更新教学内容、教书育人等）
教学手段（请打√选择）：
板书 实物□标本□挂图□模型□投影□幻灯 录像□CAI（计算机辅助教学）□
教学过程设计和教学内容：多媒体教学，讲授法、启发式提问法
教学内容：
牛血清IgG的提取
原理
从血清纯化抗体的方法很多，本实验将采用辛酸沉淀非免疫球蛋白和硫酸胺沉淀免疫球蛋白两个步骤，从血清中纯化多克隆IgG抗体。辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀腹水或血清中的非Ig蛋白；当加入33%-45%饱和硫酸胺时，IgG可被沉淀。
3.仪器：聚丙烯酰胺凝胶电泳系统、凝胶成像系统
实验步骤
、第1步改为：将清洁的0.5×7.5cm玻璃管（1支/2人），一端套上带有玻璃珠的橡皮管（同时滴入2滴蔗糖并检查有无漏水）垂直插在小试管上，以备制胶。从冰箱中取出下列试剂，在室温中平衡，然后在一小烧杯中依此加入。
2、第2步：迅速用吸管吸取上述混合液沿管柱注入玻管中，每管0.8ml-1.0ml，随即用滴管经针头沿管壁缓慢加入蒸馏水约0.5cm高度以隔氧；改为迅速用吸管吸取上述混合液沿管壁柱注入玻管中至离管口1cm，加满蒸馏水以隔氧。
材料、试剂、仪器
1.实验材料：牛血清
试剂：辛酸、硫酸铵
仪器：离心机
实验步骤：
1)准确量取牛血清5mL于500mL烧杯中，加入60mmol/L pH5.0醋酸缓冲液10mL，用盐酸溶液调pH4.5。
2)以每毫升稀释液加入50µL正辛酸的比例，在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温搅拌30min，4℃，5000r/min离心30min，弃去沉淀。
3)上清液4℃预冷，以1mL上清液加0.227g硫酸铵的比例，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温下继续搅拌30min，5000r/min离心30min。
4)将沉淀溶于20mL生理盐水中，透析过夜，离心去沉淀，上清液即为粗提IgG。
聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳检测
原理
一、实验原理
（一）浓缩效应
在pH=6.7的浓缩胶中带电粒子的泳动速度为: Cl- >protein>Gly，蛋白质样品夹在Cl-和Gly之间被挤压成一条狭窄的区带,使蛋白质样品浓缩。
4、第4步，电流为2～5mA/管，待第一色带到达胶管下段约1cm时停止电泳；改为电流为6mA/管，待第一色带到达胶管下段约2cm时停止电泳。
三、注意事项
1、丙烯酰胺和甲叉双丙烯胺是神经性毒剂，过硫酸铵为有毒成份，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触（漏胶时不要用手接触）。大量操作时应在通风橱中进行。
助教
授课时间
2012年12月1日第15周星期六第1-12节第10次课
授课时数
12学时
授课班级
生物技术专业（本科 专科□）2010级1班
教学课型
理论课□实验课 见习课□习题课□讨论课□其它□
教材名称、作者、出版社及出版时间
《基础生物化学实验》，高等教育出版社，魏群，2009
教学目的要求：
1.掌握血清IgG的粗提原理和方法
3、第3步然后取预染血清50μl加在凝胶面上，再沿管壁缓慢加入电泳液直至管的顶端，改为沿管壁缓慢加入电泳液直至管的顶端，用200μl枪取预染血清50μl加在凝胶面上；删除取血清0.2ml，加苏丹黑B丙二醇液0.02ml，加25%蔗糖溶液0.02ml，混匀，室温放置45min后, 2000r/min离心5min。