第七章 DNA文库

在mRNA中不存在的某种特定序列，有关这类的信息
就只能从染色体
一般程序：
1)提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA 片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成 cDNA； 2) DNA分子的片段化和末端修饰 3) 与其他DNA分子或载体分子进行体外重表达的蛋白质进行鉴定。
• 克隆片段易于从载体分子上完整卸下
• 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
7.3.2 Genomic Sequences and Coverage N = ln(1 - P) ln(1 - f) N = number of clones P = probability of recovering a sequence, f = fraction of the genome of each clone
基因组DNA
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因7.1.3 cDNA library
• A cDNA library represents a sample of the mRNA purified from a particular source (either a collection of cells, a particular tissue, or an entire organism), which has been converted back to a DNA template by the use of the enzyme reverse transcriptase. • It thus represents the genes that were being actively transcribed in that particular source under the physiological, developmental, or environmental conditions that existed when the mRNA was purified.
优点： a）直接利用第一链的反应产物，不需纯化 b）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
缺点： 获得的d strand synthesis--the Gubler/Hoffman protocol
3）均聚物引导法
Homopolymer tailing
7.1.2 Genomic library
• A genomic library is a set of clones that together represents the entire genome of a given organism.
• For most practical purposes, the tissue source of the genomic DNA is unimportant because each cell of the body contains virtually identical DNA (with some exceptions).
Genetic Engineering
Lecture 7 Constructing DNA Library
Dr. Zheng Xuesong Shanghai Institute of Technology
Lecture 7 Constructing DNA Library
7.1 Definitions for two types of DNA Library 7.2 Preparation of cDNA for library construction
7.3 cDNA library
7.4 Genomic library
3 strategies for isolating the target genes interested: • Chemical synthesis • PCR cDNA library • DNA library
GenomicRNA的提取和mRNA的分离 第一条cDNA合成 第二条cDNA合成 双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载 体并导入宿主中繁殖
cDNA libraries
7.2.1 利用poly-A逆转录合成cDNA第一链
oligo(dT)引导的D库的过大，以减轻筛选工作的压力 • 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆
• 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆 排序
7.1.2 Genomic library
• 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性 内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA 片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应 的宿主细胞获得的所保存某种生 物的全部基因。
7.1.2 Genomic library
Applications of genomic libraries include:
• Determining the complete genome sequence of a given organism • Study of the function of regulatory sequences in vitro • Study of genetic mutations in cancer tissues
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，
加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段， 由反转录酶合成cDNA的第一链。
缺陷：因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5’－末端， 必须从3’－末端开始合成cDNA。对于大分子量的较长的 mRNA分子而言，特别麻烦。
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly
7.1 Definitions for two types of DNA Library
7.1.1 definition for “DNA library" refers to a population of organisms, each of which carries a DNA molecule (genomic DNA fragments or cDNA) inserted into a cloning vector, or alternatively to the collection of all of the cloned vector molecules.
7.1.3 cDNA library
Applications of cDNA libraries include: • Discovery of novel genes • Cloning of full-length cDNA molecules for in vitro study of gene function • Study of the repertoire of mRNAs expressed in different cells or tissues • Study of alternative splicing in different cells or tissues
如何富集低丰度mRNA？
• 均一化处理
• 扣减杂交(**)
ESTs: Expressed Sequence Tags
• Full length cDNAs hard to get, difficult to scale up • But short cDNA sequences are often useful – ID and map specific genes – “High throughput” allows very fast generation of 200-300 bp sequences, or ESTs • Millions of ESTs in database • Useful in designing “microarrays” (later)
外显子
结构基因
内含子 转录、加工修饰基酸顺序，可
以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列的结构直接推
导出来； 2. 从特定组织提取控序列，或是
优点：a. 有放大作用，适于研究低丰度mRNA b. 不需纯化去除mRNA c. 保持了5’端的完整性。
• 5）载体引物引导合成法
7.2.4 DNA linker or adaptor
添加linker或者adaptor的方法 • 制作linker or adaptor: 在合成第一链和 第二链引物时引入酶切位点。 • cDNA合成后，用DNA聚合酶处理，产 生平头末端，然后添加linker or adaptor.
作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或 反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。
缺点： 在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会 导致对应于mRNA 5’端的地方的序列出现缺失和重排。 S1核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双链cDNA 分子。
Second strand synthesis: early methods
Problem step
Loss of some of the mRNA 5’ end
2）置换合成法
原 理： 以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为 切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上 造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆 菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链。7.1.3 cDNA (cDNA library) ：
• 是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经 反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组， 储存于某种受体ry DNA，互补DNA)：是由生 物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA经体外。
primed cDNA synthesis) ： 根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷 酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成 第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的 情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许 多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的 oligo(dT)引物一处开始。
Random priming
7.2.5 cDNA克隆载体的比较
• 质粒载体 • λ gt10 原理：cI插入失活 • λ gt11 原理：lacZ融合蛋白 • λ ZAP MCS有6个酶切位点，适于定向克隆 有T3和T7启动子，适于合成DNA探针
含有f1衍生序列，可以穿梭到pBluescri成cDNA第二链
• cDNA第二链的合成就是将上一步形成的 mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的 过程。 • cDNA第二链的合成的方法大致5种： 自身引导合成法、置换合成法、均聚物引导法、 PCR法和载体引物引导合成法。
1）自身引导合成法：
获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力，以此
均聚物引导法获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
But many cDNAs are not full-length-how get only full-length cDNAs?
Utilize the 5’ CAP structure on eukaryotic mRNAs:
• 4）PCR法：