根皮素脂质体的制备及性质1试验目的了解脂质体的性质和应用

1实验目的
2实验原理
脂质体是一种人工制备的携有双层包膜的磷脂质小囊，它具有类似于细胞膜的结构，构成双分子层的类脂亲水性的头部形成膜的表面，而亲脂性的尾部则处于膜的中间，正是由于脂质体的这种结构使其能够携带各种亲水的，疏水的和两性的物质。

它们被包于脂质体内部水相，插入类脂双分子层或吸附连接在脂质体的表面。

随着细胞膜在细胞间物质传递以及细胞识别中功能及地位的确定，脂质体作为药物载体已被广泛研究。

到目前为止，已知对许多药物进行了由脂质体作为载体的实验。

其优越性主要表现在五个方面：(1)可将抗原天然靶向网状内皮系统，优先被巨噬细胞等抗原呈递细胞(APC)所摄取，并对包裹的抗原或药物有缓释作用；(2)副作用少、程度轻，无全身毒性反应,可生物降解，本身无免疫原性；(3)可改变免疫应答的类型和方式，还可产生免疫记忆；(4)通过改变脂质体大小和电荷，可以控制药物在组织内的分布与在血清中的清除率；(5)可用单克隆抗体等配体修饰脂质体,使药物靶向病变部位(即药物导弹)。

因此,脂质体在疫苗、药物输送、基因治疗等方面显示出明显的优越性。

根皮素是国外新近研究开发较多的一种新型皮肤美白剂。

根皮素主要存在于苹果、梨等水果及多种蔬菜的根皮或根茎中；另外，根皮苷水解断裂糖苷键，除去糖基后也可得到根皮素。

本实验采用超声法制备两种根皮素脂质体，用紫外分光光度法、荧光光谱法考察药物根皮素与脂质体的相互作用，并计算包封率，考察β—环糊精（CD）对药物包埋程度的影响；显微观察脂质体结构形态，考察其稳定性。

3仪器及试剂
仪器：旋转蒸发器，恒温水浴锅，循环水真空泵，超声波清洗仪，旋涡混合器，紫外可见分光光度计，显微镜，真空干燥箱，PH计，台式高速离心机。

试剂：卵磷脂，根皮素，8—氨基萘—1—磺酸季胺盐（ANS），β—环糊精，其它分析纯试剂：混合磷酸盐，四硼酸钠，甲醇，氯仿等。

4实验步骤
4.1 脂质体的制备
缓冲液的配制：根据文献配制0.1mol.l-1的HCl(用移液管移取8.3ml分析纯HCl，二次水稀释至1L)；配制0.1 mol.l-1 Tris (称6.0574gTris二次水稀释至500ml)，取500 ml 0.1mol.l-1 Tris 碱溶液和420 ml 0.1mol.l-1的HCL混合，加NaCl 8.775 g, 加水稀释至1000ml。

先将60ml 洁净的容量瓶稳置于电子天平上，然后调零。

直接准确称取50mg 卵磷脂于容量瓶中即可。

用移液管加入5ml 有机溶剂（氯仿/甲醇：9/1）于装卵磷脂的容量瓶中。

30℃旋转蒸发直至有机溶剂完全蒸干,在器壁上形成一层均匀的薄膜为止。

N 2保护下温浴中15min ，均匀混合在超声波清洗器中超声15min 。

4.2 载药脂质体的制备
称取50 mg PC 于容量瓶中, 用 5ml 有机溶剂（氯仿/甲醇：9/1）溶解，再加入20 mg β—环糊精，待β—环糊精溶解后，加入6.9 mg 根皮素，同样方法制备根皮素脂质体，药物的最终浓度为5×10-4mol/L.
4.3 脂质体与药物作用的紫外光谱
根皮素在紫外区有强烈的吸收，根皮素的吸收峰大约在318nm 左右，以标准缓冲液为参比溶液。

将制备好的空白脂质体、PH=7.4的缓冲液、根皮素以不同的体积比加入到比色皿在200~370nm 的范围内进行扫描。

4.4 脂质体的形态分析
将离心后的脂质体溶液分别取少许，用光学显微镜观察其形态。

用滴管吸取少量脂质体溶液于载玻片上，然后用盖玻片盖住，应避免出现气泡，将其置于显微镜上，用40倍物镜观察。

每种脂质体分别取上层和底层，比较其形态的不同。

4.5 药物包封率的测定
在测定药物的包封率时，首先必须绘制出标准曲线，在一定的条件下配制一系列具有不同浓度根皮素的标准溶液，然后在确定的波长和光程等条件下，分别测量根皮素系列溶液的吸光度，绘制出A~C （吸光度~浓度）曲线，从而得到一条通过原点的曲线，即标准曲线。

根据比尔定律A=kbc ，只要知道任意浓度溶液的吸光度，就可以计算出它的浓度。

标准曲线绘出后，将上述制备的脂质体加入10ml 离心管中，10000转/min ，离心40分钟，取出上层清液，然后一一测定经过离心过滤后脂质体中没有被包封药物的吸光度，根据标准曲线计算浓度，从而计算包封率。

包封率按式6-3进行计算。

100%×C C -C =EN 121 ------------------------------------------------------------6-5
其中C 1为药物的起始浓度，C 2为高速离心后溶液中未被包封药物的浓度。

5数据记录与处理
（1）紫外光谱的记录与比较；
（2）脂质体显微形态观察；
（3）按公式6-5计算包封率。

6结果讨论
根皮素的水溶液最大吸收波长位于λ=280nm处，随着脂质体的加入，λ=280nm处的吸收峰的强度依次降低。

与中性情况下的峰变化趋势相反，表明酸性环境不利于根皮素与脂质体的结合而形成包合物，吸收峰下降仅仅是对极性环境向疏水环境转变的反应。

通过脂质体对根皮素包封率的检测，证实根皮素与脂质体的亲和性好，脂质体对药物的包封率高，可以达到80%以上，加入β—CD对包封率几乎没有影响。

【思考题】
试分析根皮素脂质体制备及其性质探索的意义。