ELISA实验

2.1试剂与仪器
2.1.1试剂
赭曲霉毒素A(OTA)单抗，实验室自制；大米粉、脱脂奶粉，超市购买。

羊抗鼠二抗（HRP标记）美国GeneTex公司；实验用水，Millipore制备的超纯水；氯化钠、甲醇，上海陆都化学试剂厂。

ELISA底物显色A液：柠檬酸0.21 g，乙二胺四乙酸二钠0.36 g ，超纯水定容至60 mL，然后加入溶有0.05 g TMB的丙酮溶液40 mL；
ELISA底物显色B液：三水乙酸钠2.45 g，过氧化脲0.5 g，冰乙酸3 mL，加蒸馏水定容至500 mL。

ELISA底物显色液：使用时，显色A液与显色B液按体积等比例混合。

终止液（2 mol/L硫酸）：量取890.62 mL蒸馏水，逐滴加入109.38 mL
浓硫酸（质量分数为98％）。

0.01 mol/LpH7.4PBS缓冲液：称取8.0g NaCl，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2
g KCl，0.2 g KH2PO4用蒸馏水溶解并定容至1000 mL。

0.01 mol/L0.5％PBST（pH7.4）：称取8.0 g NaCl，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2 g KCl，0.2 g KH2PO4用蒸馏水溶解并定容至1000 mL，再加入Tween-20 0.5 mL。

2.1.2仪器
超纯水仪，美国Millipore公司； Wellwash洗板机，美国Thermo公司；
酶标仪，美国Thermo公司；微电脑霉菌培养箱，上海博迅实业有限公司医疗
设备厂；分析天平，瑞士梅特勒·托利多公司；96孔酶标板，美国Costar公司。

2.2 酶联免疫吸附实验标准曲线的建立和样品的测定
①赭曲霉毒素A抗原以3μg/mL的浓度包被酶标板，每孔加入120 µL，置
37 ℃的保温箱中保温2 h；
②用洗板机洗酶标板3次，每孔加入320 µL 5％脱脂奶粉，于37 ℃保温
箱封闭1.5 h；
③用洗板机洗酶标板3次，其中一条板加入以下不同浓度的赭曲霉毒素毒
素A（0 ng/mL， 0.05 ng/mL，0.2 ng/mL，0.5 ng/mL，2.5 ng/mL，10ng/mL）各50 µL，另一条板大米样品提取液各50 µL，在每孔加入稀释比例为1:24000的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体各50 µL，混匀，置37 ℃保温箱中保温40 min；
④用洗板机洗酶标板4次，每孔加入1∶3000酶标二抗 100 µL，置37 ℃
保温箱中保温45 min；
⑤用洗板机洗酶标板4次，每孔加入底物显色溶液100 µL，置于37 ℃保湿闭光8 min；
⑥每孔加入2 mol/L硫酸终止液50 µL，用纸将酶标板底部的水擦干，在酶标仪450 nm处测定OD值；
⑦计算各浓度的结合率，制作标准曲线，并计算样品加标回收率。

结合率（%）= B-B空白/B0-B空白×100%（B0为不加OTA的OD值，B为加OTA的OD值，B空白为加入 100 µL PBS的OD值）。

2.2.4最佳抗体工作浓度的确定
①酶标板每列分别用不同浓度赭曲霉毒素A抗原（1 µg/mL和3 µg/mL）包被，每孔120 µL，置37 ℃保温箱中保存2 h；
②用洗板机洗酶标板3次，每孔加入320 µL 5％脱脂奶粉，于37℃保温箱封闭1.5 h；
③用洗板机洗酶标板3次，每个孔加入以下浓度的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体（1∶4000， 1∶8000，1∶16000，1∶32000），并做一个孔为空白（1×PBS），每孔100 µL，置37℃保温箱中保温40 min；
④用洗板机洗酶标板4次，每孔加入1∶3000酶标二抗 100 µL，置37℃保温箱中保温45 min；
⑤用洗板机洗酶标板4次，每孔加入底物显色溶液100 µL（加入之前，先将显色A液和显色B液等量混合）。

置于37 ℃保湿闭光8 min；
⑥每孔加入2 mol/L硫酸终止液50 µL，用纸将酶标板底部的水擦干，在酶标仪450 nm处测定OD值。