微生物限度检查法质控要点

微生物限度检查法质控要点
蒋煜国明(山东省药检所) 郑力真(山东省药检所)
摘要：本文结合省药检所的检验实际，对微生物限度检查法的主要质控要点和申请人在研究过程中容易出现的问题进行了初步梳理，以期引起申请人对该部分研究内容的关注，并不断提高研究质量
和申报质量。

关键词: 微生物限度检查法质控质量标准
一、概述
微生物限度检查是检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染的方法。

中国药典2005年版在2000年版基础之上，要求对微生物限度检查进行方法验证。

微生物限度检查法验证工作实际上是一个系统性工作，涉及到细菌选择、供试液处理，考察供试品以及试验方法、试验环境等对微生物的影响情况多方面内容。

本文结合在山东药检所的学习和交流，初步梳理了微生物限度检查方法的质控要点。

另外由于中国药典2005年版执行时间较短，申请人对该检查项方法验证工作不熟悉，也使部分申报资料以及产品质量标准出现了各种问题。

本文拟初步就微生物限度检查方法的质控要点以及申请人所出现的常见问题进行分析，以希申请人能提
高该项检查的研究质量。

二、质控要点与研发中容易出现的问题
（一）试验本身
1、验证试验的完整性
微生物限度检查法验证的质量与验证试验的完整性，以及验证方法的科学性密切相关。

验证工作不完整，遗漏或缺省了部分验证工作，不能完全体现供试品和试验过程对微生物的影响情况，很可能影响或干扰了对最终试验结果的判断。

以下是该部分试验设计或操作中的一些需要重点关注的地方，也是药检所审核过程中发现申请人最容易出现问题的部分：（1）中国药典2005年版要求对于细菌、霉菌和酵母菌的计数方法的验证，应该采用5种试验菌，即大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌。

有些申请人只对部分试验菌进行方法验证，特别是容易忽视对黑曲霉菌的验证。

中国药典2005年版根据不同制剂的给药途径，要求对不同的控制菌进行检查，并在中国药典2000年版基础上，增加了大肠菌群检查法和梭菌检查法。

部分申请人未注意到该变动内容，从而少做或
漏做了上述内容。

（2）某些供试品含有抗微生物物质，需要采取适当方法消除或抑制供试品中抗微生物物质的活性。

因此在对供试液进行特殊处理时，既要考察供试品的抑菌活性，还要考察在供试液制备过程中微生物受影响的程度，即按照中国药典附录中的要求采用稀释剂对照组的方法进行判断。

部分申请人对供试液采取了消除抑菌作用的特殊处理方法，但未用稀释剂对照组进行对照，或者简略了部分
操作步骤。

（3）计数验证应进行3次独立平行试验，要求分别取样3次，尤其是菌液组也应独立进行3次平行试验。

在3次平行试验基础上应分别计算每次试验菌的回收率，分别对每次试验结果进行判断。

而不是计算平均值后进行判断。

在复核过程中，发现部分申请人未完全理解进行独立平行试验的意义，仅提供了一次试验的数据，或者将同一供试品溶液同时分别作三份平行，作为三次试验，对于菌液组也仅提供了一次试验的数
据，无法保证验证试验的完整性，无法判断试验结果。

2、验证试验的科学性
（1）菌种选择：中国药典要求所有试验菌不应该不超过5代。

另外应该根据不同剂型或者制剂的不同给药途径选择控制菌。

个别申报资料忽视了上述要求，选择的控制菌不符合要求。

对于某些含动物组织（包括提取物）的制剂，新版药典要求对沙门菌进行检查，但是对于某些非动物组织，但是由动物来源的药物，如某由马尿中提取的药物，是否检查沙门菌，药典没有明确规定。

但是考虑到其来源，收集和保存过程的污染可能性，认为还是应该对沙门菌进行检查。

由于胶囊壳的主要成分明胶来源为动物皮或者骨，也应该对胶囊壳或胶囊进行沙门菌检验。

（2）供试液的制备：中国药典2005年版要求根据供试品的理化和生物学性质，选择供试液的
制备方法。

另外，在检查沙门菌时，中国药典2005年版要求供试液的检验量为10g或者10ml，中国药典2000年版的检验量为1g和1ml，两版药典的检查限度不变，比较而言前者提高了质量要求。

部分申请人在试验过程中未注意到上述变化，仍采用原检验量进行考察。

（3）进行细菌计数方法验证时，大部分抗生素类药物试验组应将供试液过滤，冲洗，以去除抑菌作用，并在最后一次冲洗液中加入试验菌，过滤。

但有申请人在制备试验组供试液时，在冲洗前
就加入试验菌，或者是过滤后再加入试验菌。

建立稀释剂对照组目的是考察供试液制备过程对微生物的影响，而不仅仅是考察稀释剂对微生物的影响。

所以在进行稀释剂对照组的试验时，有的申请人采用稀释剂加菌液注皿培养的方法是不妥当的。

正确的方法是与供试液的处理方法一致，如薄膜过滤法计数，应采用相应稀释液替代供试品，加入试验菌，按照试验组的供试液制备方法，薄膜过滤、冲洗，培养。

而不是过滤稀释液后再在最后一次冲洗时加入试验菌。

这时，需注意稀释剂对照组加入试验菌的步骤与试验组有所不同，另外还需要注意保持冲洗量和冲洗方法与试验组供试液的制备方法一致。

另外，中国药典2005年要求验证过程中的试验组供试液，应取样品的最低稀释级，除原液外，一般指1:10的稀释级别，有申请人误解了最低稀释级的含义，配制成1:1000的样品。

（4）为保证方法的可行性，中国药典规定了各菌液的浓度，试验过程中应该注意是否在要求范围内。

如在进行结果判断时，细菌、霉菌和酵母菌的浓度应为50～100cfu，在试验中因各种原因可能使菌落数过多或过少，造成计数结果误差较大，在这种情况下应重新试验。

（5）在对控制菌进行检查时，为了验证该控制菌检查方法的专属性，设立了阴性对照组，阴性对照组的增菌培养基应与验证菌一致。

如验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌。

此时，金黄色葡萄球菌的增菌培养基应与大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌的增菌培养基一致，而不应选择金黄色葡萄球菌的常规增菌培养基。

（6）有些申请人为了使验证资料在审核时一次通过，把所有品种（无论有无抑菌活性）均用薄膜过滤法处理，甚至每个品种的冲洗量都定为1000ml，既增加了实验过程的复杂性、造成浪费，又易于造成微生物生物活性的破坏，影响试验结果。

（二）申报资料
试验本身的完整性和科学性是保证试验质量的前提，申报资料的信息完整、可操作性强会大大提高试验过程工作效率和对试验结果准确性的判定。

某些试验本身没有问题，但是撰写申报资料时提供的信息不全面，可操作性差，或者质量标准用语不规范、或者不准确。

致使无法判断试验过程和
试验结果的科学性。

如某申请人，在申报资料中仅注明试验菌为3代，未说明具体菌种，也不说明供试品的冲洗次数和具体加菌的方法，这种情况下无法对试验结果进行复核；另如某些质量标准中，不注明供试液的制备方法，为新药审评、药检所复核以及上市后的抽验工作带来困难。

三、小结
通过上述讨论，我们发现部分申请人在提交给省药检所或者国家药品审评中心的研究资料中，以
及产品的质量标准中，多多少少都存在不足。

这主要是由于研究经验的缺乏、对方法学验证的意义理解不够，或者试验过程不规范所造成。

这些不规范，或者不严谨的质量研究过程以及质量标准给药检所的复核工作以及国家药品审评中心的审评工作，带来极大的困难，也延长了申请人的申报周期。

同时方法的不严谨可能会使试验结果出现假性结果，产生无法正确揭示产品质量的潜在隐患。

在此感谢山东省药检所的大力支持。

并欢迎对微生物限度检查以及方法验证工作感兴趣的同仁
对该部分研究工作作进一步探讨。