亚麻响应低钾胁迫转录谱分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2021, 47(6): 1070 1081 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail: zwxb301@
本研究由国家重点研发计划项目(2018YFD0201100), 黑龙江省现代农业产业技术协同创新体系麻类药用资源遗传改良与创新利用协同创新岗(YYM19SQ-24), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-16-E04)和黑龙江省农业科学院科技创新工程专项(2019JCQN003, HNK2019CX08-05)资助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0201100), the Heilongjiang Province Modern Agricultural Industry Technology Collaborative Innovation System-Hemp (medicinal) Resources Genetic Improvement and Innova-tive Utilization Collaborative Innovation Post (YYM19SQ-24), the China Agriculture Research System (CARS-16-E04), and the Science and Technology Innovation Project of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences (2019JCQN003, HNK2019CX08-05).
*
通信作者(Corresponding author): 康庆华, E-mail: qinghuakang111@
第一作者联系方式: E-mail: huangwengong1736@
Received (收稿日期): 2020-06-22; Accepted (接受日期): 2020-11-13; Published online (网络出版日期): 2020-12-15. URL: https:///kcms/detail/11.1809.S.20201215.0849.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2021.04133
亚麻响应低钾胁迫转录谱分析
黄文功1 姜卫东1 姚玉波1 宋喜霞1 刘 岩1 陈 思1 赵东升1 吴广文1 袁红梅1 任传英2 孙中义3 吴建忠4 康庆华1,*
1
黑龙江省农业科学院经济作物研究所, 黑龙江哈尔滨 150086; 2 黑龙江省农业科学院食品加工研究所, 黑龙江哈尔滨 150086; 3
黑
龙江省农业科学院畜牧研究所, 黑龙江哈尔滨 150086; 4
黑龙江省农业科学院草业研究所, 黑龙江哈尔滨 150086
摘 要: 钾是亚麻生长发育必需的大量元素。

本研究以钾高效利用亚麻品种Sofie 为试验材料, 在低钾处理12 h 和96 h 下, 利用转录组测序及qRT-PCR 进行低钾胁迫下差异基因表达调控的研究。

结果表明, 低钾处理7 d 的亚麻叶片边缘变黄, 与对照相比, 低钾处理植株矮化。

筛选出对低钾响应强烈的3个钾运转蛋白基因LusKC1 (Lus K channel 1)、LusSKOR (Lus STELAR K + outward rectifier)和LusHAK5 (Lus high affinity K + transporter 5), 低钾胁迫响应峰值时间为12 h 和96 h; 与对照相比, 低钾处理12 h 鉴定到差异表达基因1154个(508个上调, 646个下调), GO 功能富集分析表明, 这些差异表达基因主要富集于代谢过程、细胞进程、单一生物过程、催化活性和结合功能五大类, KEGG 通路富集分析表明, 这些差异表达基因涉及到能量代谢、碳水化合物代谢、碳代谢、氨基酸代谢、萜类化合物代谢和植物激素信号转导等通路。

进而筛选出7个与钾直接相关基因(4个钾运输蛋白、2个钾通道蛋白及1个钠钾钙交换蛋白)、13个与激素相关基因以及6个与纤维素合成相关基因。

7个与钾直接相关基因中, 2个基因表达量上调1.75倍和2.64倍, 5个基因表达量下调1.21~9.57倍。

以上解析的差异基因初步揭示了亚麻低钾涉及的转录调控途径, 可为亚麻耐低钾相关基因的克隆与功能验证奠定基础。

关键词: 亚麻; 低钾; 转录组; 差异表达基因
Transcriptome profiling of flax (Linum usttatissimum L.) response to low potas-sium stress
HUANG Wen-Gong 1, JIANG Wei-Dong 1, YAO Yu-Bo 1, SONG Xi-Xia 1, LIU Yan 1, CHEN Si 1, ZHAO Dong-Sheng 1, WU Guang-Wen 1, YUAN Hong-Mei 1, REN Chuan-Ying 2, SUN Zhong-Yi 3, WU Jian-Zhong 4, and KANG Qing-Hua 1,*
1
Institute of Industrial Crops, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, Heilongjiang, China; 2 Food Processing Institute,
Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, Heilongjiang, China; 3 Institute of Animal Husbandry Research, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, Heilongjiang, China; 4 Institute of Forage and Grassland Science, Heilongjiang Academy of Agri-cultural Sciences, Harbin 150086, Heilongjiang, China
Abstract: Potassium (K) is an essential element for the growth and development in flax. Transcriptome sequencing and qRT-PCR were used to investigate the regulation of differential gene expression after 12 h and 96 h of low-K + treatment. The results showed that the leaf edge of flax treated with low-K +
for 7 days turned yellow, and the plants were dwarfed compared with the control.
第6期黄文功等: 亚麻响应低钾胁迫转录谱分析1071 LusKC1 (Lus K channel 1), LusSKOR (Lus STELAR K+ outward rectifier) and LusHAK5 (Lus high affinity K+ transporter 5) were detected to respond to low-K+ with response peak time of 12 h and 96 h. Compared with the control, 1154 differentially expressed genes (DEGs) (508 up-regulated and 646 down-regulated genes) were identified in low-K+ treatment for 12 h. GO enrichment showed that DEGs were mainly concentrated on five categories: metabolic process, cellular process, single biological process, catalytic activity and binding function. KEGG pathway enrichment showed that DEGs involved in energy metabolism, carbohy-drate metabolism, carbon metabolism, amino acid metabolism, terpenoid metabolism and plant hormone signal transduction pathways. Furthermore, 7 genes directly related to K (4K transporters, 2K channel proteins and 1 sodium-potassium-calcium ex-changer protein), 13 genes related to hormone and 6 genes related to cellulose synthesis were screened. Among the 7 genes di-rectly related to K, the relative expression of 2 genes were up-regulated by 1.75 and 2.64 times and 5 genes down-regulated by 1.21–9.57 times. In summary, DEGs preliminarily revealed the transcriptional regulation pathway involved in low-K+ in flax, which laid a foundation for cloning and functional verification of flax low-K+ tolerance related genes.
Keywords: flax; low potassium; transcriptome profiling; differentially expressed genes
中国耕地土壤钾含量普遍低, 以土壤中速效钾含量70 mg kg-1为标准, 中国低钾土壤总面积约2.27×108 hm2 [1], 严重制约了作物的正常生长发育。

中国钾肥施用量从2011年的6.05⨯109 kg增加到2017年的1.95⨯1010 kg [2-3]。

大量施用钾肥, 不仅增加生产成本、加速钾资源枯竭, 并造成环境污染问题。

研究表明, 不同物种甚至同一作物不同品种在土壤钾素利用上表现出显著差异[4]。

最近, 转基因等方法被用来提高钾吸收和利用效率[5]。

这些措施将缓解钾素资源的进一步枯竭, 并提高作物产量和品质。

亚麻(Linum usttatissimum L.)是一种广泛种植的经济作物, 有悠久的栽培历史。

钾是亚麻生长发育必需的大量元素。

对亚麻钾吸收和利用进行科学研究, 提高亚麻对低钾胁迫适应性, 对于中国农业化肥实现“双减”, 保护环境, 避免过量施用化肥造成的环境污染, 实现绿水青山理念, 实现中国生态农业绿色可持续发展有重要意义。

钾是植物生长的必需元素, 是植物体内含量最高的阳离子, 占植物干物质总量2%~10%, 在生长发育中起重要作用[6-8]。

植物中的钾调节许多物理过程包括植株生长、产量和品质参数[9]。

钾参与光合作用及叶绿素合成, 钾是植物体中重要的渗透调节物质。

K+迁移对低钾土壤中的植物生长至关重要, 已发现许多钾通道, 如KT/KUP/HAK转运蛋白家族[10-12]和KCOs家族[13]。

还发现其他具有双重功能的转运体, 包括具有Na+和K+转运体双重功能的HKT转运体[14]和CBL-CIPK, 后者受Ca2+信号通路调节, 并激活AKT1通道[15-17]。

此外, ROS信号通路中的RCI3/RAP被认为激活转运体HAK。

植物低钾表现明显症状为茎弱、容易倒伏、叶片失水、耐旱性和耐寒性降低、蛋白质和叶绿素分解、叶片变黄最终组织坏死[18]。

目前已发表的亚麻基因组序列图[19]极大地促进了亚麻的研究。

亚麻的简化基因组测序结果表明, 遗传图谱总长度为1483.25 cM, 2339个标记均匀分布于15个连锁群, 分别对应于亚麻15条染色体, 相邻标记间平均距离为0.63 cM, 该图谱是目前为止密度最高的亚麻全基因组遗传连锁图谱[20]。

有学者提出一种涉及激活蛋白的低钾反应机制的存在[21]。

目前亚麻对低钾胁迫的分子机制及参与这一调控过程的基因仍不明晰。

特定响应基因表达的变化决定了钾胁迫下亚麻形态及生理变化, 差异基因表达研究有利于揭示钾胁迫下亚麻内在的分子响应机制, 为分子辅助品种选育奠定基础。

本研究以亚麻品种Sofie为研究材料, 深入挖掘低钾胁迫下Sofie中的差异表达基因, 通过揭示钾胁迫相关的分子及信号通路, 以期为亚麻耐低钾相关基因的克隆与功能验证奠定基础。

1 材料与方法
1.1 植物材料
钾高效利用亚麻品种Sofie由国家麻类种质改良中心亚麻分中心提供。

1.2 生长条件及胁迫处理
将Sofie种子播种于装有蛭石(已经过121℃湿热灭菌20 min)的纸杯中, 纸杯置于塑料托盘上, 每个托盘浇等体积水, 每个纸杯播种30粒种子。

出苗至胁迫处理前每3天浇1/2 MS, 将播种后的亚麻置于相对湿度70%的植物培养箱中, 23, 16 h
℃光照/18,
℃8 h黑暗。

设MS培养基中的K+浓度(20 mmol L-1)和0 (0 mmol L-1) 2个钾处理梯度。

在Sofie生长至3对真叶时(出苗后7 d)进行2种浓度的钾处理, 每个组培瓶中放置10株均匀一致的亚麻植株, 每个组培瓶200 mL培养液, 处理重复3次。

每3 d更换1次培养液, 直至出现低钾症状(叶片边缘变黄)为止。

1072作物学报第47卷
生长一致的3周Sofie幼苗正常浇MS培养液(充足的K+供应, 含KCl)作为低钾对照(CK), 浇低钾培养液(无KCl)的作为低钾处理(KS)。

CK营养液是改变的MS培养液, KCl代替KNO3。

CK和KS胁迫12 h和96 h, 整株苗取样, 液氮冻后-80℃贮存, 供RNA提取用于后续测序分析。

1.3 qRT-PCR引物
根据拟南芥中的钾运转蛋白相关基因, 在网站(/pz/portal.htmL)设计亚麻LusKC1、LusSKOR、LusAKT2、LusHAK5、LusKUP2、LusKUP3、LusKUP12、LusKEA5、LusCHX17共9个基因的引物, 每个基因设计3对引物。

1.4 转录组测序
采用TIANGEN RNA prep pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA。

用TIANGEN Tgem Spectrophotometen检测所提取RNA A260/A280比值及浓度。

CK和KS处理12 h和96 h提取的Sofie整株植株RNA (3次重复)分别命名为12h-CK-1、12h-CK-2、
表1本研究用于qRT-PCR的引物
Table 1 Primers used for qRT-PCR in this study
引物名称Primers
正向引物
Forward primers (5'-3')
反向引物
Reverse primers (5'-3')
LusKC1-1 CATTGTCCTCACTTTCTTTGTCGC CGAACCATGGCTTAGTGAGATACC LusKC1-2 CATTGTCCTCACTTTCTTTGTCGC TAGATGAACTGAAACGGTAGGGTG LusKC1-3 CGACTTGGCGGTGGATGCTT TAGATGAACTGAAACGGTAGGGTG LusSKOR-1 GTCTCGTCATTCATCCCGACAACA CCAACAATGTCCAAAATGAAGAGAT LusSKOR-2 GTCTCGTCATTCATCCCGACAACA TAATCCCCTGAAGAATCCAAACTCC LusSKOR-3 TTCCATCACGTCTCCACCGGT TAATCCCCTGAAGAATCCAAACTCC LusAKT2-1 TTCATAAACGGAGGTCATCTCTTCT GACAATCTCAGCAGCATAAAGCCTC LusAKT2-2 TTCATAAACGGAGGTCATCTCTTCT TCAGGCTTAAGATCTCGATGCACAA LusAKT2-3 GTCATCCATCCTTTCATCGTCCAGC GACAATCTCAGCAGCATAAAGCCTC LusHAK5-1 GTTTCCAAGACAACACAAGGCG GATGTTCCGATGTCGCCGTA
LusHAK5-2 GTTTCCAAGACAACACAAGGCG ATGTCGCCGTAGACCACTCCA
LusHAK5-3 CCAAGACAACACAAGGCGGC GATGTTCCGATGTCGCCGTA LusKUP2-1 TGTTCAAGTATGTGTTCATTGTTCT GGACAATGATTCATCTGAGACCTGC LusKUP2-2 TGTTCAAGTATGTGTTCATTGTTCT TGATTCATCTGAGACCTGC
LusKUP2-3 GCTGATGACAATGGAGAGGGT GCAAACAAGGCTACCAGTATGAT LusKUP3-1 CACCCCTGCCCTTTCTGTTT TAGATGAACTGAAACGGTAGGGTG LusKUP3-2 CACCCCTGCCCTTTCTGTTT TATGATGCATGTAGCTGGGAGT LusKUP3-3 CTTGCTGGTTTTGGCGTT GCAAACAAGGCTACCAGTATGAT LusKUP12-1 TGGTGGGACTATGAGGAGGAG CCATGTCGCCATAGACCACT
LusKUP12-2 TGGTGGGACTATGAGGAGGAG ACTCCAAGCGTTTGAAAGGC
LusKUP12-3 AGGAGGAGGTTGGTGAAGAAG CCATGTCGCCATAGACCACT
LusKEA5-1 ATGAGAAGGGCAAGAAAAATGA GACGTTATCCTTTTTGTCAATGA LusKEA5-2 ATGAGAAGGGCAAGAAAAATGA CAGCACAGGATATTTAGATTTCTTG LusKEA5-3 AGGGCAAGAAAAATGACACACA GACGTTATCCTTTTTGTCAATGA LusCHX17-1 CTCACTCGCATCCTCGCTTT ACTGTGAGAGACTTATGTGGGAA LusCHX17-2 CTCACTCGCATCCTCGCTTT TATGTGGGAAGATAGTGTTGAGG LusCHX17-3 ATCCTCGCTTTCCTCCTC ACTGTGAGAGACTTATGTGGGAA LusEF1A GCTGCCAACTTCACATCTCA GATCGCCTGTCAATCTTGGT LusUBI CCTCCTTGATAGCAGCCTTG CTCCGTGGAGGTATGCAGAT LusTUA CCTGTTGGGAGCTTTACTGC AAGGTGTTGAAGGCATCGTC
LusEF2 GTGGTGCTGAGATCACGAAA AGACGGTTATGCTTGTTGGG LusActin GGTGTTATGGTTGGAATGGGTC CCTCAGTGAGAAGTACAGGGTG
第6期黄文功等: 亚麻响应低钾胁迫转录谱分析1073
12h-CK-3、12h-KS-1、12h-KS-2、12h-KS-3、96h-CK-1、96h-CK-2、96h-CK-3、96h-KS-1、96h-KS-2和96h-KS-3。

总RNA的质量和数量分析、建库及Illumina 测序由华大基因公司(BGI, Shenzhen, China)完成。

RNA-seq相应数据(编号: SRP120129)上传至公共数据库NCBI (https:///)。

1.5 qRT-PCR分析
按上述方法提取总RNA。

TIANGEN RNAprep pure Plant Kit已含有去基因组DNA试剂, 逆转录时省去该步骤。

逆转录方法采用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (Code No. FSQ-301)。

RNA的变性: 将RNA 65 5 min
℃, 立即冰上冷却。

逆转录反应体系为10 µL, 包含RNA template 0.5 pg~0.5 µg、Nuclease-free Water、5×RT Master Mix II。

轻轻搅拌反应溶液, 以下温度进行反应: 37 15 min
℃, 50 5 min
℃, 98 5 min
℃, 4℃保存。

将1 μg总RNA合成第1链cDNA。

PCR反应体系为95 3 min
℃; 95 5 s
℃, 60 40 s
℃, 72 10 s
℃, 45个循环。

为验证引物特异性, 45个循环后进行溶解曲线绘制。

qRT-PCR试验设置3次生物学重复。

qRT-PCR试验内参基因为LusActin。

利用2−ΔΔCt计算基因相对表达量。

利用Primer 3 (http://frodo.wi.mit. edu/primer3)设计引物。

1.6 统计分析
所有试验3次重复, 数据用平均值 标准差(SD)表示。

采用SPSS 17.0软件分析数据, 各组间比较采用单因素方差分析。

P<0.05的值为显著差异。

2 结果与分析
2.1 亚麻低钾胁迫响应时间的确定
2.1.1 亚麻低钾胁迫处理前后亚麻表型Sofie 出苗7 d, 在蛭石中的生长状态及各植株生长情况见图1-A。

由图1-B可看出, 各植株生长一致, 长势良好。

处理时, 对照和处理的生长状态见图1-C。

处理7 d, 低钾和对照的生长状态见图1-D和E。

说明低钾处理7 d植株出现叶片边缘变黄症状, 与对照相比, 低钾处理植株矮化。

2.1.2 亚麻低钾胁迫标记基因筛选以低钾处理48 h K0的cDNA稀释10倍为模板进行PCR, 筛选标记基因引物及内参。

从图2-A~C可看出, 引物LusKC1-1、LusSKOR-1、LusHAK5-2、LusKEA5-2和LusActin特异性好。

本试验从4个特异性好的标记基因引物LusKC1-1、LusSKOR-1、LusHAK5-2和LusKEA5-2中选取3个标记基因LusKC1、LusSKOR、LusHAK5及内参LusActin进行qRT-PCR 试验。

图1亚麻低钾处理前后植株表型
Fig. 1 Plant phenotype of before and after treatment of low-K+ in flax
A: 蛭石中生长; B: 处理前的植株表型; C: 低钾胁迫对照和处理的生长状态; D: 处理后低钾和对照的植株表型; E: 处理后低钾和对照的单株表型。

a: 低钾胁迫的植株表型; b: 对照的植株表型。

A: growth in vermiculite; B: plant phenotype before treatment; C: growth condition of control and treatment under low-K+ stress; D: plant phenotypes of low-K+ and control plants after treatment; E: single plant phenotype of low-K+ and control after treatment. a: plant phenotype under low-K+; b: plant phenotype of control.
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作 物 学 报 第47卷
图2 亚麻低钾胁迫标记基因筛选
Fig. 2 Screening of marker genes for low-K + stress in flax
M: DL2000; 1: LusKC1-1; 2: LusKC1-2; 3: LusKC1-3; 4: LusSKOR-1; 5: LusSKOR-2; 6: LusSKOR-3; 7: LusAKT2-1; 8: LusAKT2-2; 9: LusAKT2-3; 10: LusHAK5-1; 11: LusHAK5-2; 12: LusHAK5-3; 13: LusKUP2-1; 14: LusKUP2-2; 15: LusKUP2-3; 16: LusKUP3-1; 17: LusKUP3-2; 18: LusKUP3-3; 19: LusKUP12-1; 20: LusKUP12-2; 21: LusKUP12-3; 22: LusKEA5-1; 23: LusKEA5-2; 24: LusKEA5-3; 25: LusCHX17-1; 26: LusCHX17-2; 27: LusCHX17-3; 28: LusEF1A; 29: LusUBI; 30: LusTUA; 31: LusEF2; 32: LusActin.
2.1.3 亚麻低钾胁迫响应时间筛选 在低钾胁迫6 h 、12 h 、24 h 、48 h 、96 h 、192 h 、10 d 和15 d 时, 利用筛出的标记基因引物LusKC1-1、LusSKOR-1、LusHAK5-2及内参LusActin 引物进行qRT-PCR 试验。

从图3可看出, LusKC1在12 h 和96 h 表达量显著高于其他时间(P <0.05); LusSKOR 在12 h 和96 h 表达量高, 这2个时间LusSKOR 表达量显著高于其他时间(P <0.05); LusHAK5在12 h 和96 h 表达量显著高于其他时间(P <0.05)。

综合3个标记基因LusKC1、LusSKOR 和LusHAK5 qRT-PCR 表达情况发现, 3个标记基因12 h 开始高表达, 96 h 表达处于另一个高峰。

选取低钾处理及对照在12 h 和96 h 取样, 进行后续转录组测序。

图3 亚麻低钾不同时间点对LusKCL 、LusSKOR 和LusHAK5
表达的影响
Fig. 3 Effects of different time on the relative expression of LusKC1, LusSKOR , and LusHAK5 under low-K + treatment in flax
同一基因中不同小写字母分别表示在0.05水平差异显著。

Different lowercase letters mean significant differences at the 0.05 probability level during the same gene.
2.2 亚麻低钾的RNA-seq
2.2.1 亚麻低钾转录组测序统计分析 利用低钾12 h 和96 h Sofie 及对应时间对照样品总RNA 构建Illumina 测序文库。

每个文库平均得到38.07 Mb 原始测序读数, 其中95.38%以上为过滤读数。

将过滤读数与亚麻基因组序列比对, 至少86.17%读数成功与数据库参考基因组序列比对上(表2)。

2.2.2 亚麻低钾差异表达基因筛选 本研究将差异表达基因的差异倍数阈值设为≥2.0, q -value 阈值设为≤0.05。

利用q -value 阈值＜0.05和log 2 ratio 的绝对值≥1来筛选出低钾的差异表达基因。

低钾12 h 鉴定到1154个(508个上调表达, 646个下调表达)低钾响应表达基因。

低钾96 h 差异表达基因明显减少, 共鉴定到247个(131个上调表达, 116个下调表达)低钾响应表达基因。

图4-A 展示了不同低钾时期的差异表达基因的异同情况, 18个基因在两时期均响应, 其中上调基因8个, 下调基因10个, 推测这些基因可能在整个低钾时期有重要功能。

图4-B 显示低钾对照组和处理组差异基因数。

比较这些结果消除了基因表达与时间和生长相关的自然变异。

在CK 组和KS 组中, 有886个基因共同表达, 其中343个基因上调, 543个基因下调。

2.3 GO 功能富集
对差异表达基因(1154个)进行GO 功能富集发现, 在12h-KS vs. 12h-CK 对比组差异基因主要富集于代谢过程、细胞进程、单一生物过程、催化活性和结合功能五大类(图5)。

第6期黄文功等: 亚麻响应低钾胁迫转录谱分析1075
表2亚麻12个转录组数据的主要特性
Table 2 Main characteristics of 12 transcriptome data in flax
样品Sample
总的原始读数
Total raw reads (Mb)
总的过滤读数
Total clean reads (b)
比对读数
Compared reads
比对特异性
Compared specificity (%)
比对基因
Compared genes
12h-CK-1 38.07 36,976,258 32,381,211
87.57% 82.01 35,281
12h-CK-2 38.07 36,547,552 31,737,232
86.84% 81.82 34,782
12h-CK-3 38.07 36,309,778 31,468,060
86.67% 80.67 35,320
12h-KS-1 38.07 36,507,590
32,071,565
87.85% 83.38 35,352
12h-KS-2 38.07 36,763,226
32,059,054
87.20% 81.62 35,351
12h-KS-3 38.07 36,513,816
31,749,080
86.95% 81.41 35,429
96h-CK-1 38.07 36,886,386 32,109,249
87.05% 81.79 35,608
96h-CK-2 38.07 36,515,094 31,576,196
86.47% 81.72 35,270
96h-CK-3 38.07 36,494,576 31,449,058
86.17% 81.15 35,260
96h-KS-1 38.07 36,956,330
32,146,308
86.98% 81.33 35,807
96h-KS-2 38.07 36,737,316
32,133,744
87.47% 82.20 36,263
96h-KS-3 38.07 36,409,348
31,493,300
86.50% 81.31 35,141
图4亚麻低钾响应差异表达基因的维恩图
Fig. 4 Venn diagram of DEGs under low-K+ in flax
A: 亚麻低钾处理后12 h和96 h差异基因数; B: 低钾对照组和处理组差异基因数。

A: the number of DEGs at 12 h and 96 h after low-K+ treatment in flax; B: the number of DEGs in control and low-K+ treatment.
图5亚麻低钾12 h差异表达基因的GO富集
Fig. 5 GO enrichment of the DEGs under low-K+ treatment after 12 h in flax
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2.4 KEGG 通路富集
为进一步理解差异表达基因的功能, 将12h-KS vs 12h-CK 对比组所有差异基因(1154个)与KEGG 数据库比对, 确定差异表达基因参与的最主要的能量代谢(光合有机物固碳、光合作用), 碳水化合物代谢(戊糖、果糖磷酸途径、甘露糖代谢)、碳代谢、氨基酸代谢、萜类化合物代谢和植物激素信号转导通路(图6)。

差异表达基因中有本研究关注的pathway 注释的基因为5个, 富集的途径有5条, 包括光合作用途径(photosynthesis) 1条、植物激素信号转导途径(plant hormone signal transduction) 3条及萜类主链生物合
成途径(Terpenoids backbone biosynthesis) 1条。

其中基因Potassium transporter 5-like (MSTRG.20565.1)表达量上调2.64倍, 在光合作用途径中负责K +运输; 基因TIR (MSTRG.7397.8)表达量上调8.52倍, 在生长素合成途径中负责生长素的合成; 基因AHP1 (MSTRG.25736.1)表达量下调1.81倍, 在细胞分裂素合成途径中负责细胞分裂素的合成; 基因CTR1 (MSTRG.16160.5)表达量下调6.23倍, 在乙烯合成途径中负责乙烯的合成; 基因FEI1 (MSTRG.5636.3)表达量下调1.86倍, 在萜类主链生物合成途径中负责细胞壁的合成。

图6 亚麻低钾12 h 差异表达基因的KEGG 通路富集
Fig. 6 KEGG pathway enrichment of the DEGs under low-K + treatment after 12 h in flax
2.5 差异表达基因的功能分析
2.5.1 亚麻低钾下与钾直接相关基因筛选 本研究在亚麻低钾转录组数据的差异基因中筛选出7个与钾直接相关基因(表3), 包括4个钾运输蛋白(MSTRG.20565.1、MSTRG.24915.2、MSTRG.10817.1和MSTRG.6817.1), 2个钾通道蛋白(MSTRG.4695.1和MSTRG.30540.1)及1个钠钾钙交换蛋白(MSTRG .14498.2)。

其中2个上调基因(MSTRG.20565.1和MSTRG .4695.1), 5个下调基因(MSTRG.24915.2、MSTRG.10817.1、MSTRG.30540.1、MSTRG.14498.2和MSTRG.6817.1), 这些基因可能在钾胁迫响应中起重要作用。

本研究发现, 许多差异表达基因在低钾胁迫信
号转导和离子转运体调控通路中扮演重要角色, 如附图1。

1个AKT 通道蛋白(上调2.15倍), 参与钾通道转运, 响应于非生物胁迫; 19个CIPK 信号转导蛋白(上调1.46~11.76倍), 参与钙信号传导, 响应于非生物胁迫; 1个CML 信号转导蛋白(上调3.74倍), 参与钙信号传导, 影响植物生理代谢; 2个ARF 信号转导蛋白(下调3.25倍和4.61倍), 参与生长素调控, 影响侧根发育; 5个NRT 转运蛋白(下调1.14~4.69倍), 参与硝酸盐转运, 影响植物的生长发育。

鉴于这些基因直接参与钾信号传导及K +运输, 与Wang 等[22]报道一致。

推测低钾胁迫将直接影响这些基因的表达, 进而影响亚麻中钾信号的传导及K +运输, 从而影响亚麻的表型。

第6期黄文功等: 亚麻响应低钾胁迫转录谱分析1077
表3亚麻低钾下7个与钾直接相关基因筛选
Table 3 Screening of 7 genes directly related to low-K+ treatment in flax
基因收录号Gene ID
基因名称
Gene name
KS/CK的log2值
log2 FC
注释
Annotation
MSTRG.20565.1 Potassium transporter 5-like 2.64 钾转运蛋白Potassium transporter
MSTRG.24915.2 Potassium transporter, putative -1.21 钾转运蛋白Potassium transporter
MSTRG.10817.1 Hypothetical protein EUGRSUZ_E04300-1.23 钾转运蛋白Potassium transporter
MSTRG.6817.1 Potassium transporter 7-like -9.57 钾转运蛋白Potassium transporter
MSTRG.4695.1 Uncharacterized protein isoform 2 1.75 钾电压通道Potassium voltage-gated channel MSTRG.30540.1 Potassium channel SKOR-like isoform X1-1.40 钾通道Potassium channel
MSTRG.14498.2 Nucleolar protein nop56, putative -3.01 钠钾钙交换器Sodium potassium calcium exchanger
2.5.2 亚麻低钾下与激素相关基因筛选在所有差异对比组中, 共103个基因注释到激素响应蛋白功能, 包括17个ABA响应蛋白、16个乙烯响应蛋白、22个生长素响应蛋白、10个JA响应蛋白以及38个细胞分裂素响应蛋白。

本研究发现, 13个与激素直接相关的基因(表4), 其中1个TIR (上调8.52倍), 一种植物生长素受体, 参与植物生长调控; 2个AUX (下调1.44倍和1.51倍), 生长素响应基因, 应答生长素效应; 1个ARF (下调9.62倍), 生长素初期响应基因; 2个GH3 (下调
3.02倍和3.58倍), 植物生长素原初反应基因, 参与植物生长素调节; 1个AHP (下调 1.81倍), 一种组氨酸磷酸转移蛋白, 参与细胞分裂素的负向调控; 1个EIN2 (下调10.02倍), 乙烯信号关键基因, 参与乙烯信号通路的正向调控; 2个EBF (下调1.20倍和3.10倍), 负反馈调控EIN3, 参与乙烯信号转导; 3个CTR1 (下调6.23倍、1.90倍和7.72倍), 介导乙烯受体的信号负调控乙烯反应。

本研究筛选出生长素合成通路6个基因, 包括1个TIR、2个AUX、1个ARF、2个GH3, 低钾胁迫下, 这些基因调控亚麻植株生长, 造成植株矮化; 细胞分裂素合成通路1个基因AHP, 低钾胁迫下, AHP调控细胞分裂, 造成亚麻植株矮化的表型; 乙烯合成通路6个基因, 包括3个CTR、1个EIN、2个EBF, 低钾
表4亚麻低钾下13个与激素相关基因筛选
Table 4 Screening of 13 hormone related genes under low-K+ treatment in flax
激素种类Hormone kinds
基因登录号
Gene ID
基因名称
Gene name
KS/CK的log2值
log2 FC
注释
Annotation
MSTRG.4702.1 AUX -1.44 生长素诱导蛋白Auxin-induced protein
MSTRG.13772.1AUX -1.51 生长素诱导蛋白Auxin-induced protein
MSTRG.7397.8 TIR 8.52 Toll/interleukin-1受体Toll/interleukin-1 receptor MSTRG.6782.4 ARF 9.62 含家族蛋白的ARF-GTPase激活域
ARF GTPase-activating domain-containing family protein MSTRG.29326.1GH3 -3.02 吲哚-3-乙酸酰胺合成酶GH3
Indole-3-acetic acid-amido synthetase GH3
Auxin
MSTRG.14003.4GH3 -3.58 吲哚-3-乙酸酰胺合成酶GH3
Indole-3-acetic acid-amido synthetase GH3 Cytokinine MSTRG.25736.1AHP1 -1.81 含组氨酸磷酸转移蛋白1
Histidine-containing phosphotransfer protein 1 MSTRG.16160.5CTR1 -6.23 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶CTR1亚型X1
Serine/threonine-protein kinase CTR1 isoform X1 MSTRG.19624.1CTR1 -1.90 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶CTR1亚型X1
Serine/threonine-protein kinase CTR1 isoform X1 MSTRG.15232.4CTR1 -7.72 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶CTR1亚型X1
Serine/threonine-protein kinase CTR1 isoform X1 MSTRG.36331.6EIN2 -10.02 假定蛋白Hypothetical protein
MSTRG.40444.1EBF1 -1.20 假定蛋白Hypothetical protein
Ethylene
MSTRG.12066.1EBF1 -3.10 假定蛋白Hypothetical protein
1078作物学报第47卷
胁迫下, 这些基因引起亚麻植株衰老, 即叶片变黄(附图2)。

这3个通路为揭示植物激素对低钾胁迫反应分子机制奠定基础[23]。

低钾胁迫可能诱导这些基因差异表达, 调控激素合成, 进而影响亚麻的生长发育。

2.5.3 亚麻低钾下与纤维素相关基因筛选本研究在差异表达基因中筛选出6个与纤维素相关基因(表5), 包括2个Exo70 (下调8.70倍和2.13倍), 组成胞泌复合体的关键亚基, 参与复合体在靶膜组装; 2个COB23 (下调2.03倍和1.73倍)及1个COB21 (下调1.94倍), 植物糖磷脂酰肌醇锚定蛋白, 定向微纤丝, 突变后阻碍纤维素合成; 1个FEI1 (下调1.86倍), 一种双特异性蛋白激酶, 参与纤维素合成。

本研究筛选出2个Exo70、2个COB23、1个COB21和1个FEI1 (附图3), 鉴于这些基因直接参与纤维素合成[24], 低钾胁迫可能诱导这些基因表达, 抑制亚麻纤维素合成, 进而调控产量形成。

表5亚麻低钾下6个与纤维素相关基因筛选
Table 5 Screening of 6 genes directly related to cellulose under low-K+ in flax
基因收录号Gene ID
基因名称
Gene name
KS/CK的log2值
log2 FC
注释
Annotation
MSTRG.20574.4 Exo70 -8.70 胞外复合蛋白Exocyst complex protein MSTRG.29262.1 Exo70 -2.13 胞外复合蛋白Exocyst complex protein MSTRG.16464.2 COB23 -2.03 外被体亚单位Coatomer beta subunit MSTRG.16464.1 COB23 -1.73 外被体亚单位Coatomer beta subunit MSTRG.18050.1 COB21 -1.94 外被体亚单位Coatomer beta subunit MSTRG.5636.3 FEI1 -1.86 双特异性蛋白激酶Dual specificity protein kinase
2.6 RNA-Seq和qRT-PCR相关性
为验证转录组测序分析结果, 随机选取Lus10024152、Lus10021422、Lus10028689、Lus10040830、Lus10024511、Lus10013304、Lus10024074和Lus10009092等8个基因用于qRT-PCR 分析。

2种方法得到的基因表达变化数据相关系数R2达到0.91 (图7), 说明RNA-seq测序数据相对准确, 低钾相关基因表达量结果可信。

图7RNA-Seq和qRT-PCR相关性
Fig. 7 Correlations between RNA-Seq and qRT-PCR
3 讨论
3.1 低钾对亚麻表型的影响及亚麻响应低钾的时间
植物长期受到低钾胁迫时, 会出现黄化病, 老叶先显现症状[25]。

植物低钾影响茎叶及根的生长发育[26-27]。

植株茎叶低钾早期老叶叶尖失绿。

随低钾时间增加, 萎黄症状从老叶转移到新叶。

严重低钾时, 植物叶子从叶尖到整个叶缘显现出萎黄病, 最终坏死。

随腐胺在叶片中积累, 植物叶片萎黄并发生大量褐斑。

与上述植物低钾表型相似, 低钾亚麻植株出现叶片边缘变黄症状, 并表现出矮化的表型。

研究表明, 西瓜低钾响应早期和后期的时间点分别为6 h和120 h[28]。

而本研究通过亚麻低钾8个时间点筛选出12 h和96 h为亚麻低钾响应的早期和后期时间点。

与西瓜低钾响应不同的是, 亚麻低钾响应早期时间(12 h)晚于西瓜(6 h), 但亚麻后期响应时间(96 h)早于西瓜(120 h)。

3.2 植物低钾胁迫的信号转导和离子转运体调控
本研究2个ARF信号转导蛋白(下调3.25倍和4.61倍), 参与生长素调控, 影响侧根发育; 5个NRT转运蛋白(下调1.14~4.69倍), 参与硝酸盐转运, 影响植物的生长发育。

鉴于这些基因直接参与钾信号传导及钾离子运输, 与Wang等[22]报道一致。

推测低钾胁迫将直接影响这些基因的表达, 进而影响亚麻中钾信号的传导及K+运输, 从而影响亚麻的表型。

钾是植物生长所需的主要营养物质。

对低K+条件的适应性机制主要为钙调磷酸酶B样蛋白
第6期黄文功等: 亚麻响应低钾胁迫转录谱分析1079
(Calcineurin B-like Calcium Sensors, CBL)和CBL相互作用激酶(CBL-Interacting Protein Kinases, CIPK)组成的Ca2+信号网络。

低钾胁迫信号转导和离子转运体调控通路涉及大量膜上K+信号转导蛋白和离子通道基因及细胞质和核中一些信号转导蛋白及离子转运蛋白。

低钾胁迫通过调控细胞质和细胞核中一些信号转导蛋白影响膜上相关信号转导蛋白和离子通道基因表达(附图1)[22]。

本研究低钾胁迫发现大量差异表达基因, AKT通道蛋白在亚麻低钾处理后其表达量上调2.15倍, 而拟南芥中CIPK23及KC1协同调控AKT1介导低钾胁迫[29], 水稻中过表达AKT1可通过提高组织内K+含量提高植株对渗透和干旱胁迫抗性[30], 说明AKT通道蛋白在亚麻和拟南芥或水稻有类似功能; 发现CIPK信号转导蛋白在亚麻低钾处理后其表达量上调 1.46~11.76倍, 而杨树中CBL-CIPK信号通路可通过调控Shaker-like钾通道增加对低钾胁迫耐受性[31], 说明CIPK信号通路在亚麻和杨树有类似功能; 发现ARF信号转导蛋白在亚麻低钾处理后其表达量下调3.25倍和4.61倍, 而拟南芥中低钾胁迫下ARF2磷酸化可解除对K+转运基因HAK5抑制, 促进钾吸收[32], 说明ARF信号转导蛋白在亚麻和拟南芥有类似功能; 发现NRT转运蛋白在亚麻低钾处理后其表达量下调 1.14~4.69倍, 而拟南芥中NPF7.3/NRT1.5介导的NO3–迁移可通过调控SKOR影响K+从根到芽迁移[33], 说明NRT 转运蛋白在亚麻和拟南芥有类似功能。

鉴于这些基因在低钾胁迫亚麻中的表达明显改变, 推测这些基因在亚麻对低钾胁迫的响应中发挥着重要作用。

3.3 植物激素在低钾胁迫中的作用
植物激素广泛参与逆境生理和生化反应。

乙烯是植物对非生物胁迫应答中重要信号分子之一, 它与乙烯受体等主要转录因子结合, 激活下游基因表达, 触发乙烯应答[34]。

生长素可诱导ARF/AUX/GH3等基因在植物胁迫应答中快速瞬时高表达[35]。

脱落酸作为植物地下-地上部分之间信息传递的中心媒介, 通过激活K+进出细胞路径诱导细胞膨胀压变化[36]。

植物激素也相互影响, 乙烯和生长素通过抑制主根生长而促进根毛伸长, 从而对低钾胁迫下根系形态发育起指导作用。

生长在低钾条件的植物根形态类似于生长在响应外源乙烯和生长素处理的形态[37]。

低钾条件下, 乙烯合成和信号转导相关基因表达增强[38]。

4 结论
利用qRT-PCR筛选出亚麻对低钾响应强烈的3个标记基因及内参分别为: LusKC1、LusSKOR、LusHAK5和LusActin。

钾胁迫相关基因对低钾响应高峰时间出现在12 h和96 h。

通过低钾转录组数据的分析和挖掘, 确定7个与钾直接相关基因(4个钾运输蛋白、2个钾通道蛋白及1个钠钾钙交换蛋白), 低钾胁迫直接影响亚麻这些基因的表达, 进而影响亚麻中钾信号的传导及K+运输; 确定13个与激素相关基因(生长素合成通路6个基因、细胞分裂素合成通路1个基因和乙烯合成通路6个基因), 低钾胁迫诱导这些基因表达, 调控激素合成, 进而影响亚麻生长发育; 确定6个与纤维素合成相关基因(2个EXOCYST、3个COB和1个FEI基因), 低钾胁迫诱导这些基因表达抑制亚麻纤维素合成, 进而调控产量形成。

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