第十四章 电泳分离技术

▪ 连续胶与不连续胶:
连续胶：胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份不变 不连续胶:胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份变化
连续胶的制胶过程与点样过程
样本梳
间
间
隔
隔
条
条
玻璃板 (前,后)
不连续胶的制胶过程与点样过程
样本梳
浓缩胶
间
间
隔
隔
条
条
分离胶
玻璃板 (前,后)
梯度或固定浓度胶
商品预制胶
■ 电泳凝胶系統的組成：
▪ PAGE是根据被分离物质所带 电荷的多少及其分子大小、形 状不同，在电场作用下产生不 同的移动速度而分离。它具有 电泳和分子筛双重作用
■ 凝胶的聚合反应：
Ammonium persulfate (free radical initiator)过硫酸铵
(O4S-SO4 )2-
2 SO4-
自由基的生成者
43
36
30
20.1
1.0 18.5
14.4
Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis
■ 电泳槽及相关设备：
转 印夹
电泳槽
制
胶
器
转印槽
电泳仪
■
电泳开始
直
100~150 V
立 式
-+
电
泳
Upper
chamber
裝
置
：
Lower
chamber
与缓冲液的离子强度无关？
■
Buffer pH
环
10
境 影
9
响
8
分
7
子 的
Isoelectric point, pI
6
带
5
电 性
4
质
3
：
+
0 --
Net Charge of a Protein
■
Buffer pH
环
10
境 影
9
响
8
分
7
子 的
Isoelectric point, pI
6
带
5
电 性
4
质
▪ 琼脂凝胶电泳：常用pH6-9;离子强度 0.02-0.05;硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液； 浓度常用1%-1.5%
▪ 琼脂凝胶电泳的优点：？？ 1. 近似自由界面 2. 液固相间无明显界面，电泳速度快 3. 不吸收紫外线，可直接用紫外检测仪测定 4. 容易染色易洗脱
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
Cooling Water
+
Stacking Gel
Running Gel
增溶\除不溶性杂质
SDS的量及处理方法
Model 491 Prep Cell 制备型电泳仪
公司：Bio-Rad
▪ 根据不同分子量的蛋 白在凝胶中的迁移率 不同而起到分离作用， 虽然该方法有着较高 的分辨率（在理论上） 和大的上样量（mg 级），但由于对制胶 有着很高的要求，以 及目的蛋白的极度稀 释、发热问题无法解 决和SDS参与分离过 程给后期处理带来一 系列问题均无法很好 地解决，故该方法以 趋于淘汰。
电泳技术问题及对策
4.表面活性剂(SDS等)强烈破坏 蛋白质分子间的非共价作用, 使蛋白质分子为表面溶剂分子 所包围,阻止了蛋白质之间的 相互作用,同时也消除了不同 蛋白质固有的电荷差异;
电泳技术问题及对策
5.控制电泳介质的有效黏 度,包括选择适当的凝胶 孔径和添加能增加介质 黏度的物质;
电泳技术问题及对策
一.平板电泳:水平平板电泳;垂直平板电泳 二.连续凝胶电泳: 三.等电聚焦电泳: 四.连续流动电泳 五.无载体连续流动电泳
思考
▪ 什么是等电点电泳?什么是等电聚焦电泳? 二者的主要差别在什么地方?
思考
a)决定蛋白质分子的净电荷为正电或负电，受那些因素影 响？
b)那些因素会影响蛋白质分子，在电场中的泳动速率？ c)凝胶溶液的成分有那些？ 各有什么作用？ 那一种有毒性？ d)浓缩胶如何使样品蛋白质焦聚成一薄层？ e)是否所有蛋白质分子均由负极向正极泳动？ 在什么情况
下会有例外？
f) 电泳进行时会发热，有无必要通冷水冷却之？ 在何种情 况下有此必要？
g)样品中若有大量的盐分，对电泳会有什么影响？ h)SDS-PAGE与non-denaturing PAGE在原理与应用上，
有何异同？
■ 联丙烯酰胺单体聚合过程：
聚 合 反 应
交联剂造成分枝
聚合反应
Bis 交錯连結 Bis
free radical
端点自由基 可再延续
自由基形成
一些概念
▪ 凝胶浓度和交联度 ▪ 不连续与连续胶 ▪ 变性胶及非变性胶
SDS (Sodium dodecyl sulfate)
十二烷基磺酸钠
凝胶的浓度和交联度
Acrylamide (monomer) 1
1
凝胶的基本單位:丙烯酰胺
2
Bis(acrylamide) (bridge)
交联使聚合产生分枝:甲叉丙烯酰胺
TEMED (catalyst):四乙基乙二胺 帮助传递自由基的催化剂
12
CH2=CH-CO-NH2
Acrylamide 有毒性！
核黄素-TEMED系统与过硫酸铵-TEMED系统
外加电流电压
Voltage
ANODE
+
+ +
CATHODE
-
Friction
Charge
分子量 分子形狀 分子的等电点
■ 影响电泳泳动率的因素：
外加电流电压
Voltage
ANODE
+
+
++
CATHODE
-
Friction
Charge
分子量 分子形狀 分子的等电点
▪ 两性的生物大分子所带电荷的 性质和数量由其等电点及溶液 环境(pH值)所决定;
电泳系統
缓冲液 pH 胶体浓度
1 上层 (负极) 缓冲液 Tris-glycine 8.3
2 样品溶液
Tris-glycine 8.3
3胶
浓缩胶 Tris-HCl
6.9
4体
分离胶 Tris-HCl
8.3
5 下层 (正极) 缓冲液 Tris-glycine 8.3
5% 7.5~20% -
● 不连续胶有聚焦样品的作用
第十四章 电泳分离技术
广州大学生命科学学院 柯德森
电泳技术原理
▪ 带正电荷的生物分子在电场 作用下向阴极移动,带负电荷 的生物分子在电场作用下向 阳极移动
▪ 泳动度(迁移率):带电质点在 单位强度电场下的泳动速度
即:U=V/E=(d/t)/(V/L)
▪ 不同分子在同一电场中可能 具有不同的泳动度
泳缓冲液的离子强度必须控制
适当.
电泳技术问题及对策
2. 蛋白质分子所带净电荷主要取决
于电泳缓冲液的pH值,应仔细调
整和控制电泳缓冲液的pH值,使 各组分分子的净电荷数差异加大. 但极端pH下蛋白质会变性失活, 因此一般控制在pH4.5~9.5之间;
电泳技术问题及对策
3. 缓冲液的种类,浓度和其他电 解质浓度影响蛋白质所带电荷 的极性和数量,同时还影响蛋 白质分子间的相互作用,因此 必须根据分离溶质的不同选择 合适的缓冲系统;
6.电泳过程发热量的控制: ▪ 发热的难题:蛋白质变性;蛋白质区带扩散,
分辨率下降; ▪ 对策: ① 减少发热:降低电流,提高电压;提高传热表
面积;提高材质的传热系数;提高冷却系统 的温差. ② 减少扩散:增加缓冲系统或介质的黏度可 以减少扩散;在微重力作用下进行电泳;
电泳技术在生物技术研究上的应用
■ 浓缩胶具有聚焦作用的三個主要作用因素：
Glycine: Negative charged No net charge
Chloride ion:
Proteins: 小分子
大分子
■ 浓缩胶对蛋白质分子的集焦作用：
A
B
C
样
8.3
本
浓
缩
6.9
胶
离子缺乏空间
分
离 胶
8.9
+
+
▪ 变性胶与非变性胶：
变性胶：胶电脉在蛋白质变性的状态下进行， 主要指SDS变性条件下进生
▪ 泳动度(迁移率)取决于带电质 点的性质，即质点所带的净电 荷的量、质点的大小和质点的 形状。
▪ 同时决定于：电泳介质阻力、溶 液黏度.
■ 影响电泳泳动率的因素：
外加电流电压
ANODE
+
-
+
Voltage
CATHODE
-
Friction
Charge
分子量 分子形狀 分子的等电点
■ 影响电泳泳动率的因素：
▪ 凝胶浓度：T（Acr和Bis总浓度） =(a+b)/m.100%
▪ 交联百分比：C（交联剂的百分比） =b/(a+b).100% a:Acr浓度；b: Bis浓度；m:缓冲液体积
凝胶的浓度和交联度
▪ 浓度和交联剂浓度决定胶的物 理状态及分子筛的孔径的大小
▪ 一般浓缩胶：2-5%，a:b=20 ▪ 分离胶：7-10%，a:b=40 ▪ 标准胶浓度：7%
AGE PAGE
X Tetramer (40,000)x4 5.8 Slow Fast Y Monomer 88,000 5.2 Fast Slow Z Monomer 60,000 9.3 Upward Medium
X - Y - Z+
Native-PAGE
蛋白质电流凝胶图
电泳技术问题及对策
1. 低离子溶液中,不同电荷的蛋白质
分子间会发生相互静电作用.增
加溶液离子强度可减少这种作用, 但会提离高子强电0度.0泳2低-0,速.时2M度的快的,离发电子热强流低度,有,使电渗产热更 多,温度升离高子强又度高促,速进度慢蛋,发白热大质的扩散, 使区带变宽,分辨率下降.因此电
X-
Y
-
Z
+
+ SDS
SDS-PAGE
XYZ
分子量 及 净电荷密度 均影响泳动率
只有 分子量 影响泳动率
■ 样品分子量的测定： SDS-PAGE
Mol mass
kD 300 200
100 80 60 50 40 30 20
10
0.5 Migration (Rf)
kD
kD
330
220
94
67
67
60
3
：
+
0 - -- -
Net Charge of a Protein
■ 电
-
+
泳
滤紙电泳 Cellulose
形
式
Protein Denatured
的
发
薄层电泳 (TLE) Cellulose acetate
展
Partial
：
Denatured
凝胶电泳 Starch → Gel
凝胶电泳包括：琼脂凝胶和聚丙烯酰 胺凝胶电泳
非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进 行，不加变性剂
■ SDS 在蛋白质表面 均勻敷上 一层负电：
SDS
boiling
原态蛋白质
变性蛋白质成一线狀分子 並且均勻帶上一层负电荷
极性头部
非极性尾部
■ 三种不同性质蛋白质的电泳比较：
Quaternary Molecular Protein Structure Weight
▪ 主要是用于蛋白质和核酸类物质的分析和 分离;
▪ 使用最广泛有效的是平板电泳;包括琼脂糖, 聚丙烯酰胺凝胶,及SDS-聚丙烯酰胺凝胶等
▪ 具有灵敏度高,重复性好,测定范围宽,适用 性强,操作容易,结果直观,设备简单等优点
生物技术产品分离纯化上电泳技术的应用
▪ 目前大规模的分离纯化电泳技术还处于发 展阶段,