水溶性阳离子型吡啶基咔咯镓配合物与人血清蛋白的相互作用

水溶性阳离子型吡啶基咔咯镓配合物与人血清蛋白的相互作用闻金燕;吕标彪;张阳;王家敏;应晓;王惠;计亮年;刘海洋
【摘要】利用紫外吸收光谱、荧光光谱、圆二色(CD)光谱和分子对接计算探究了5,10,15-三[4-(N-甲基-吡啶)]咔咯镓配合物(1-Ga)与人血清蛋白(HSA)的相互作用.结果表明, HSA的荧光能被1-Ga静态猝灭,两者的结合常数为2.82×104 L/mol,作用距离为3.342 nm.热力学参数显示1-Ga主要通过氢键和疏水作用与HSA结合,位点标记竞争实验表明1-Ga优先结合HSA的布洛芬位点Ⅱ.此外,紫外吸收光谱和CD光谱显示二者的相互作用会导致HSA α-螺旋结构的减少.分子对接计算结果表明1-Ga优先结合在HSA亚结构域ⅢA的位点Ⅱ疏水袋中.%The interaction between gallium 5 , 10 , 15-tris ( 4-methylpyridiniumyl ) corrole ( 1-Ga ) and human serum albumin( HSA) was investigated using UV-Vis spectra, fluorescence spectra, circular dichroism( CD) spectra and molecular docking simulation. The results reveal that the fluorescence quenching of HSA by 1-Ga is a static quenching process. The binding constant of complex 1-Ga with HSA is 2. 82×104 L/mol, and bin-ding distance r=3. 342 nm. Thermodynamic parameters show the interaction is mainly driven by hydrophobic and hydrogen binding forces. Site marker competition experiment indicates 1-Ga preferably bind to ibuprof en site Ⅱ of HSA. Also, α-helix content of HSA will decrease upon binding 1-Ga as indicated by UV-Vis and CD spectroscopy. Molecular docking simulation confirmed 1-Ga bind to the hydrophobic pocket site Ⅱ in domain ⅢA of HSA.
【期刊名称】《高等学校化学学报》
【年(卷),期】2015(000)006
【总页数】9页(P1033-1041)
【关键词】咔咯;镓;人血清蛋白;相互作用
【作者】闻金燕;吕标彪;张阳;王家敏;应晓;王惠;计亮年;刘海洋
【作者单位】华南理工大学化学系;应用物理系，广州510641;华南理工大学化学系;华南理工大学化学系;应用物理系，广州510641;中山大学光电材料与技术国家重点实验室;中山大学光电材料与技术国家重点实验室; 生物无机与合成化学教育部重点实验室，广州510275;华南理工大学化学系; 中山大学光电材料与技术国家重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】O614.37
人血清蛋白(HSA)是血浆中含量最多的蛋白质,它在内生和外源物质的运输、分布和新陈代谢等方面起着重要作用.药物与蛋白质的结合既可使蛋白质的构象发生变化进而影响其生理功能,也可影响药物的存在形式与生理活性[1,2],因此功能小分子化合物与HSA相互作用的研究一直是化学生物学领域的重要课题[3～5].目前,吡啶基阳离子型、磺酸基和羧酸基阴离子型咔咯是已报道的3类主要水溶性咔咯,它们的金属配合物能与DNA结合并表现出光致或氧化断裂DNA的核酸酶活性[6～12].研究发现,吡啶基阳离子型咔咯能够很好地诱导形成和稳定DNA G-四联体结构[13,14].由于细胞膜的负电性,阴离子磺酸基咔咯必须借助于转运蛋白才能进入细胞发挥作用[15～17],其镓配合物与乳腺癌细胞靶向蛋白形成复合物后,能够靶向地作用于肿瘤细胞,进而应用于肿瘤的检测和靶向治疗[18～21].磺酸基咔咯锰、铁配合
物还能够安全、快速地清除体内的活性氧和活性氮物种,在治疗动脉粥样硬化、癌症等疾病方面有潜在的应用价值[22,23].由于蛋白质的手性结构,磺酸锰、铁咔咯与蛋白质结合后可以实现对硫醚底物的手性催化氧化[24].金属镓是继铂之后的第二种治疗癌症的金属元素,其配合物的细胞渗透性好,临床证明有很好的抗肿瘤活性且毒副作用小,作为新型潜在的金属配合物药物已被广泛关注[25].
本文利用紫外吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱法和分子对接计算探讨了5,10,15-三[4-(N-甲基-吡啶)]咔咯镓配合物(图1)与人血清蛋白的相互作用.
1.1 试剂与仪器
人血清蛋白(HSA)、华法林、布洛芬和氯化镓(纯度＞99%)购于Sigma-Aldrich公司;三羟甲基甲胺(Tris)和氯化钠(NaCl)均为生物纯,购于上海生工生物工程公司;4-吡啶基苯甲醛、吡咯和其它试剂均为分析纯;实验用水为二次去离子水.
3900H型紫外-可见分光光度计(日本Hitachi公司);RF-5301型荧光分光光度计(日本Shimadzu公司),配备THX-05型温控装置;J-810型圆二色光谱仪(日本JASCO公司).
1.2 合成与表征
5,10,15-三[4-(N-甲基-吡啶)]咔咯镓配合物(1-Ga)参照文献[26]的方法制备.相关化合物的表征数据如下:
5,10,15-三[4-吡啶基]咔咯:UV-Vis(CH2Cl2),λmax/nm:417,576,615,640;1H NMR(C6D6, 400
MHz),δ:7.58(m,2H),7.71(m,4H),8.10(d,2H),8.18(d,2H),8.36(d,2H),8.49(d,
2H),8.72(s,6H);ESI-MS(CH3OH),m/z:528.2[M-H]+;元素分析实测值
(%,C34H23N7计算值): C 77.13(77.11),H 4.35(4.38),N 18.50(18.51).
5,10,15-三[4-吡啶基]咔咯镓配合物:UV-Vis(DMF),λmax/nm:431,576,617;1H NMR (DMSO-d6,400
MHz),δ:7.37(m,3H),7.78(m,2H),8.17(d,2H),8.26(d,4H),8.54(d,3H),
8.69(d,2H),8.79(d,2H),8.98(d,8H),9.26(d,2H);ESI-MS(CH3OH),m/z:596.2[M]+;元素分析实测值(%,C34H20N7Ga计算值):C 68.45(68.48),H 3.39(3.38),N
16.42(16.44).
5,10,15-三[4-(N-甲基-吡啶)]咔咯镓配合物(1-Ga):UV-Vis(Tris-HCl缓冲
液),λmax/nm:402, 484,647;1H NMR(400 MHz,DMSO-
d6),δ:4.68(d,9H),8.87(d,2H),8.97(d,6H),9.01(d,
2H),9.20(d,2H),9.38(d,6H),9.46(d,2H);ESI-MS(CH3OH),m/z:312.6[M-
3I+3H]+/2, 213.9[M-3I+2H]+/3;元素分析实测值(%,C37H29N7GaI3计算值):C 69.32(69.29),H 4.55(4.56), N 15.21(15.29).
1.3 配合物与HSA相互作用的实验方法
所有相关测定均是在Tris-HCl缓冲溶液(50 mmol/L Tris,150 mmol/L
NaCl,pH=7.4)中进行, HSA溶液的浓度由280 nm处的吸光度值和摩尔消光系数(ε280=35700 L·mol-1·cm-1)确定[27].咔咯镓配合物溶液也用Tris-HCl缓冲溶液配制,浓度按称量法确定.
荧光猝灭实验分别在298,304和310 K下进行.向3 mL 5 μmol/L的HSA溶液中逐渐加入1-Ga (0～12 μmol/L),快速搅拌使之混合均匀,体系作用平衡3 min后以280 nm为激发波长记录300～500 nm范围的荧光光谱图.
位点竞争实验在298 K下进行,分别以华法林和布洛芬作为HSA上位点Ⅰ和位点Ⅱ的标记物,以浓度比1∶1加入到3 mL 5 μmol/L的HSA溶液中,充分作用20 min 后,向体系中逐渐加入1-Ga配合物(0～12 μmol/L),快速搅拌使之混合均匀,每次滴定平衡3 min后,以295 nm为激发波长,扫描300～500 nm范围的荧光光谱图. 向3 mL 1 μmo l/L HSA溶液体系中加入一定量的1-Ga,使二者浓度比[1-
Ga]/[HSA]为10∶1,测定200～300 nm范围内配合物加入前后HSA紫外光谱图
的变化情况.
同步荧光实验操作方法与上述荧光滴定相同,扫描范围分别为280～330
nm(Δλ=15 nm)和310～380 nm(Δλ=60 nm).
向3 mL HSA(1 μmol/L)溶液中逐渐加入1-Ga储备液(0,5,10,15 μmol/L),混合均匀后放置3 min,以200 nm/min的扫描速度,在200～260 nm范围内于298 K恒温下记录圆二色谱图的变化.
分子对接计算:HSA晶体结构从PDB数据库下载(PDB ID:1E7I),5,10,15-三[4-(N-甲基-吡啶)]咔咯镓配合物分子的3D结构用Guassian View构建,并用Hartree-Fock方法对其结构进行优化,Ga原子用Lanl2DZ基组,其它原子采用6-31+G*基组.应用AutoDockTools对HSA和配合物分子结构进行编辑,并采用AutoDock 4.2程序进行分子对接.用拉马克遗传算法计算HSA和配合物1-Ga的可能构象,根据能量排序选择结合能最低的构象为结合模式,应用PyMol 0.99rc6程序分析对接结果.
2.1 荧光猝灭
HSA的内部荧光主要来自于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基.由于酪氨酸易被电离,遇到氨基、羧基时荧光几乎被完全猝灭,而苯丙氨酸的荧光量子产率很低,因此主要通过色氨酸的荧光变化来研究HSA与小分子的相互作用[28].当激发波长为280 nm时,HSA的荧光来源于色氨酸和酪氨酸两种氨基酸残基(主要是色氨酸);当激发波长为295 nm时,HSA的荧光全部来源于色氨酸残基[29].图2(A)为激发波长280 nm时HSA在不同1-Ga浓度下的荧光光谱图.可以看出,HSA在346 nm左右处有1个很强的发射峰,其强度随着配合物浓度的增加逐渐下降,但峰位和峰形基本不变,表明1-Ga与HSA之间的相互作用导致了HSA荧光的猝灭.
利用Stern-Volmer方程[30]可得到其猝灭常数:
式中,F0和F分别是配合物加入前后HSA的荧光强度;[Q]是猝灭剂(1-Ga)的浓
度;KSV是猝灭常数; Kq是猝灭速率常数;τ0是荧光分子的平均寿命,对于HSA,荧光寿命一般为10-8s[31].以F0/F对[Q]作拟合直线[图2(B)],斜率即为猝灭常数.在298 K时,1-Ga对HSA的猝灭常数是4.68×104L/mol.值得注意的是,随着HSA溶液中配合物浓度的增大,1-Ga在蛋白质的激发波长和发射波长处会产生不可忽略的吸收(内滤效应,IFE),导致猝灭常数被高估.因此,在计算荧光猝灭常数时,必须先对荧光强度做内滤效应的校正.内滤效应校正公式[32]如下:
式中,Fobsd和Fcor分别是实验测得和校正后的荧光强度,d是荧光池的宽度(1 cm),s是激发光束的宽度(0.1 cm),g是激发光束边缘到荧光池边缘的距离(0.4 cm),Aex和Aem分别是配合物在激发波长和发射波长处的紫外吸光度.经计算发现在[1-Ga]=0～12 μmol/L浓度范围,所有的校正系数(CF= Fcor/Fobsd)[32]均小于1.5,处于可接受的范围,说明采用荧光光谱法研究1-Ga与HSA的相互作用是可行的.荧光强度经过内滤效应校正后,得到的猝灭常数为2.69×104L/mol,明显小于校正前的数值.
2.2 荧光猝灭机制
蛋白质荧光猝灭分为动态猝灭和静态猝灭[29],前者是一种电子转移过程,不影响蛋白质的构象,而后者则是由于结合反应导致的荧光猝灭.测定不同温度下1-Ga对HSA荧光的猝灭常数可以区别动态和静态猝灭.表1列出了不同温度下经过内滤效应校正后的KSV和Kq数值.可以看出,随温度升高,猝灭常数KSV减小.一般来说,动态猝灭过程属于分子扩散碰撞过程,温度升高,有效碰撞几率增大,进而KSV相应地增大;对于静态猝灭,温度升高使得基态复合物稳定性下降,KSV相应减小.因此1-Ga 猝灭HSA荧光的机制属于静态猝灭.此外,配合物的猝灭速率常数Kq值(～
1012L·mol-1·s-1)远大于生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数
(2×1010L·mol-1·s-1),这也侧面反映HSA是通过与1-Ga形成复合物导致其荧光猝灭的[31].对于静态猝灭过程,其结合常数KA可以通过Scatchard方程[33]得到:
式中,F0和F分别是配合物加入前后HSA的荧光强度;[Qt]和[Pt]分别是猝灭剂(1-Ga)和HSA的浓度;n是结合位点数,以lg[(F0-F)/F]对lg(1/([Qt]-(F0-F)[Pt]/F0))作图(图3),由直线的斜率和截距可求得KA和n. 1-Ga与HSA的结合常数约为
104L/mol(表1),可以看出配合物与HSA有较强的结合作用,结合位点数约为1.同时,结合常数KA随温度升高而减小,进一步印证1-Ga对HSA荧光猝灭是静态猝灭过程.
2.3 热力学参数和作用力类型
小分子与生物大分子(如蛋白质、核酸等)之间的作用力主要有氢键、范德华力、静电作用和疏水作用.二者结合的热力学参数[焓变(ΔH),熵变(ΔS)和自由能(ΔG)]可作为判定作用力类型的依据[34],当ΔH＞0,ΔS＞0时为典型的疏水作用力,而ΔH＜0,ΔS＜0为范德华力或氢键;ΔH≈0(较小), ΔS＞0则为静电作用.1-Ga与HSA结合反应形成复合物的热力学参数可以由Van't Hoff方程得到[35]:
式中,KA为温度T下的结合常数,R为气体常数.假定在所研究的温度范围内反应的焓变ΔH和熵变ΔS为常数,以lnKA-1/T作图,由拟合直线的斜率和截距求得ΔH和ΔS,再由下述公式计算出不同温度下的自由能ΔG.
1-Ga与HSA相互作用的热力学参数列于表2.ΔG＜0说明键合过程是自发进行的;ΔS＞0表明疏水相互作用是主要作用力;同时负的焓变值(ΔH=-5.465 kJ/mol)说明可能存在氢键作用.此外,在实验测试条件下,HSA是负电性的,1-Ga配合物是正电性的,因此二者之间也存在静电作用.
2.4 结合位点
位点Ⅰ和位点Ⅱ是化合物在HSA分子上的主要结合部位,分别位于亚结构域ⅡA和ⅢA的疏水腔中,表现出类似的化学性质.位点Ⅰ疏水空腔结构较大且弹性好,大分子主要以疏水作用结合在此位点上;位点Ⅱ结构更小更窄,弹性较小,结构特殊的小分子一般以范德华力、氢键作用结合在此位点上[36].为了确定1-Ga在HSA上具体的
结合位点,选择特异性结合于HSA已知位点的华法林(位点Ⅰ)、布洛芬(位点Ⅱ)作为标记物,做位点标记竞争实验.如图4所示,当向HSA溶液中加入华法林时,HSA的荧光强度显著增强,且荧光光谱发生较大的红移;但布洛芬的加入对HSA荧光谱图的影响不大.再分别向HSA-华法林和HSA-布洛芬溶液体系中逐渐滴加1-Ga,2个体系的荧光强度出现了不同程度的下降.图5示出了在华法林和布洛芬存在时经过内滤效应校正后的Stern-Volmer和Scatchard曲线,相应的猝灭常数和结合常数列于表3.华法林和布洛芬的加入均使得1-Ga与HSA的结合常数减小,但布洛芬的影响更大,表明1-Ga在HSA的2个位点上均有结合,更倾向结合在位点Ⅱ处.
2.5 能量转移和结合距离
能量转移是由于分子间的偶极-偶极共振耦合作用使得能量从荧光给体转移到荧光受体的现象.根据Foster非辐射能量转移理论[29],能量转移的发生要求能量给体能发射荧光,能量给体的荧光光谱与受体的吸收光谱有足够的重叠且能量给体和受体之间的结合距离不超过7 nm.图6是1-Ga的紫外吸收光谱与HSA的荧光光谱的重叠图,显示二者之间能发生非辐射能量转移.能量转移效率E与结合距离r的关系如下[37]:
式中,F0和F分别是猝灭剂不存在和存在时HSA的荧光强度,R0是能量转移效率E 达到50%时的临界距离,可由下式得到:
式中,K2是给体和受体偶极跃迁的空间取向因子;N是介质的折射指数;Φ是受体分子不存在时能量给体的量子产率;J是能量给体分子的荧光发射光谱和能量受体的吸收光谱的重叠积分,可表示为
式中,F(λ)为能量给体在波长λ处的荧光强度,ε(λ)为受体在波长λ处的摩尔消光系数.实验条件下,K2=2/3,n=1.336,Φ=0.118[37].根据公式(6)～(8),计算得出
J=1.46×10-14L·cm3·mol-1, E=0.185,R0=2.611 nm和r=3.342 nm.可见1-Ga 与HSA的结合距离r＜7 nm且0.5R0＜r＜2.0R0,表明从HSA到1-Ga具有高非
辐射能量转移概率[38].
2.6 构象变化
2.6.1 紫外吸收光谱图7为1-Ga存在前后HSA的紫外吸收光谱图的变化.HSA有2个特征吸收峰,其中210 nm附近的强吸收峰反映了α-螺旋结构的信息,280 nm 附近的弱吸收峰是由HSA肽链上的芳香氨基酸残基(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)的苯环π-π*跃迁引起的[36].1-Ga的加入使得HSA最大吸收峰的强度减弱,且稍有红移现象,表明配合物与HSA的作用扰动了α-螺旋结构,同时,280 nm处的吸收峰强度有明显的增强,说明1-Ga与HSA的相互作用导致HSA肽链伸展,使其氨基酸残基中的疏水基团更加裸露.
2.6.2 同步荧光光谱利用同步荧光光谱分别考察了配合物对HSA中色氨酸残基和酪氨酸残基荧光光谱的影响.HSA中氨基酸残基的最大发射波长与其所处微环境的疏水性密切相关,发射波长红移,表明该残基所处环境的极性变大和疏水性降低,蛋白质的疏水腔变疏松,反之亦然[39].以激发波长和发射波长的间距Δλ=15,60 nm扫描可以得到HSA中酪氨酸和色氨酸的荧光光谱图[图8(A, B)].同步荧光显示HSA 的荧光主要源自于色氨酸;当HSA溶液中1-Ga浓度逐渐增加时,酪氨酸和色氨酸残基的荧光强度均有减弱,但最大发射波长没有出现明显的位移,说明1-Ga与蛋白质的结合作用对氨基酸残基附近的极性影响不大.此外,1-Ga对酪氨酸荧光强度猝灭的程度大于色氨酸[图8 (C)],说明1-Ga在HSA上的结合部位更接近于酪氨酸残基,该氨基酸残基在位点Ⅱ区域,与前面位点竞争实验的结果一致;而阴离子型磺酸咔咯镓配合物在HSA分子上的结合部位更靠近色氨酸残基[15].
2.6.3 CD光谱 CD光谱能够有效地检测蛋白质二级结构的变化.1-Ga对蛋白质CD 光谱的影响如图9所示.在远紫外区208和220 nm附近有2个负CD峰,是由HSA的α-螺旋肽键骨架π→π*和n→π*跃迁引起的[38],该CD峰的位移和强度变化反映α-螺旋结构的变化.HSA体系中随着配合物浓度的增大,峰的强度逐渐减小,
说明1-Ga与HSA相互作用扰动了蛋白质的二级结构,导致其α-螺旋结构的减少.α-螺旋的含量可由以下2个公式[37]求得:
式中,MRE208是波长208 nm处的平均残基摩尔椭圆率,n是蛋白质中的氨基酸残基数目(585);l是测试皿的光径(1 cm);cp是蛋白质的摩尔浓度.通过公式(9)和公式(10),计算得出不同配合物浓度下HSA中α-螺旋的百分含量,当HSA/1-Ga浓度比分别是1∶5,1∶10和1∶15时,α-螺旋的含量从原来66.7%分别降低到
63.4%,61.5%和58.2%.
2.7 分子对接计算
HSA的亚结构域ⅡA(位点Ⅰ)和亚结构域ⅢA(位点Ⅱ)是配合物与HSA相互作用的2个主要结合位点[39].经过分子对接计算可以得到1-Ga与HSA的最佳结合构象,发现1-Ga结合在HSA亚结构域ⅢA的疏水腔中[图10(A)],即位点Ⅱ,与前面位点竞争实验的结果一致.图10(B)显示了1-Ga分子周围的氨基酸残基,其中有疏水性残基(Ile513,Leu529,Met548,Phe551,Ala552,Val555)和亲水性残基
(Tyr401,Asn405,Arg521,Lys525,Gln526,Asp549,Cys559),说明1-Ga与HSA之间的驱动力主要为疏水和静电作用.配合物1-Ga与401位的酪氨酸残基距离较近,与同步荧光实验的结果一致.
通过荧光光谱和分子对接计算探究了阳离子型吡啶基金属镓咔咯与人血清蛋白的结合作用,并利用紫外吸收光谱和CD光谱研究了1-Ga与HSA的结合作用对蛋白质构象的影响.结果表明HSA能与1-Ga形成复合物导致其荧光猝灭,并伴随着非辐射能量转移.1-Ga与HSA之间发生了较强的结合作用,结合常数为2.82×104L/mol;根据Foster非辐射能量转移理论,计算出它们之间的结合距离为3.342 nm.两者结合的热力学参数说明其作用的驱动力主要是疏水作用和氢键作用.位点标记物华法林和布洛芬的加入均减弱了1-Ga猝灭HSA荧光的程度,后者的影响更大,表明配合物在HSA的位点Ⅰ和位点Ⅱ都有结合,且优先结合在HSA上的布洛芬(位点Ⅱ)处.
此外,1-Ga与HSA结合后对蛋白质的二级结构产生一定的影响,主要是α-螺旋结构含量的减少.分子对接计算结果显示,1-Ga结合在HSA的亚结构域ⅢA的疏水袋中(位点Ⅱ).
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