葛根素注射液对糖尿病家兔溶血作用研究

葛根素注射液对糖尿病家兔溶血作用研究
曹烨君;丁选胜
【摘要】Objective To study the rule of puerarin injection hemolysis on normal and diabetic rabbits,and provide evidence for clinical rational administration of drug.Methods This study established type 1 diabetic rabbits model by alloxan,comparing to healthy rabbits. The dosages of treatment were 10,20,40 mg·kg -1 ,respectively.The treatment of healthy and diabetic rabbits was divided into 2 peri-ods.Every period had 10 days.Before and during the treatment blood was collected for observation of red cell morphology and compari-son of in vitro hemolysis.Results The study showed that after treatment,the hemolysis rate increased in healthy and diabetic rabbits. In 6 ~8 d,the hemolysis rate reached highest in diabetic rabbits,which was higher than healthy rabbits.The hemolysis rate had a posi-tive correlation with dosage and time.Conclusions In clinical practice,the treatment should be controlled within 8 days.If the patients need a long time of treatment,it must be divided into several
periods,which has 4 to 5 days as an interval.That would ensure drug safety and avoid hemolytic reaction.%目的：研究葛根素注射液在正常和糖尿病家兔
体内给药后的溶血规律，为临床安全合理用药提供依据。

方法采用四氧嘧啶复制1型糖尿病家兔模型，并与正常健康家兔进行对照，设置10、20、40 mg·kg －1
体质量三个剂量组，每周期给药10 d，在给药前以及每个给药周期的第2、4、6、8、10天分别采血，观察红细胞形态并比较体外溶血差异。

结果正常家兔和糖尿
病家兔红细胞在给药后的溶血率较之给药前均有升高，糖尿病组的溶血率高于正常
组，在给药后6～8 d 溶血率升至最高。

溶血率与给药剂量和给药时间成正相关。

结论临床使用葛根素注射液，给药时间应控制在8 d 以内，若需长时间用药，需要在每个用药周期后间隔4～5 d 的清洗期，以保证用药安全性，避免发生溶血反应。

【期刊名称】《安徽医药》
【年(卷),期】2016(020)008
【总页数】7页(P1433-1439)
【关键词】葛根素/副作用;溶血;糖尿病,实验性;兔
【作者】曹烨君;丁选胜
【作者单位】常州市第四人民医院临床药学室，江苏常州 213001;中国药科大学临床药学教研室，江苏南京 210009
【正文语种】中文
葛根素注射液是临床常用药物之一，临床上也发现其存在诸多不良反应，其中比较严重的是溶血性反应[1-4]，往往会导致患者死亡等严重后果。

目前，针对药物溶血反应，主要采用健康正常动物红细胞体外溶血进行评价，少见采用病理状态下动物体内给药，研究药物溶血反应。

糖尿病及其并发症作为葛根素注射液的主要适应证之一，其主要患病人群为中老年人，正是葛根素注射液不良反应发生的高风险人群。

在糖尿病病程中，红细胞会发生一系列的病理改变，如红细胞内黏度增加，聚集性增强，最终血液黏度增高，流动性降低，红细胞变形能力下降。

同时糖尿病患者的红细胞脂质过氧化会导致红细胞形态和功能的损伤，可能会增加溶血发生的概率。

在糖尿病患者中，尚缺乏药源性溶血研究。

糖尿病作为一种全身性质的疾病，
在进展过程中对于各个系统及器官都有显著的影响。

因此，选用糖尿病动物模型[5]来观察葛根素注射液给药后溶血反应更符合临床实际,可以更全面地分析葛根素对于红细胞的作用[6]。

本课题就葛根素注射液在正常和糖尿病家兔体内给药后的溶血规律加以研究，为临床安全合理用药提供依据。

1.1 实验动物及药品健康家兔36只，普通级，雌雄各半，由江苏省南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，生产许可证号：SCXK(苏)2013-0008。

葛根素注射液：青岛金峰制药有限公司，规格：200 mg/4 mL,批号130810。

1.2 糖尿病家兔模型复制用氯化钠注射液配置5%四氧嘧啶溶液，家兔禁食12 h后按照130 mg·kg-1一次性耳缘静脉注射四氧嘧啶溶液，注射后立即喂食并补充葡萄糖溶液，防止低血糖的发生。

72 h后测定空腹血糖，2次血糖值>16.7 mmol·L-1时认为糖尿病模型建立。

1.3 家兔给药方法正常及糖尿病家兔各分为3个剂量组，每组6只，经耳缘静脉，每日根据体质量按照10、20、40 mg·kg-1分为低、中、高剂量组给药。

正常及糖尿病组家兔均分为1个给药周期，每周期10 d。

给药前及每周期第2、4、6、8、10天给药后24 h采血。

1.4 采血及血样处理家兔耳中动脉采血4 mL，新鲜血液加入肝素(0.5 g·L-1血液)抗凝。

抗凝血3 000 r·min-1离心10 min，取上层清液即为血浆，-20 ℃保存备用；下层红细胞用8～10倍生理盐水洗涤2～3次，1 500 r·min-1离心15 min，至上层清液无色透明，离心后弃上层液，按所得红细胞体积加入生理盐水配置5%红细胞悬液，摇匀，4 ℃保存备用。

1.5 家兔红细胞与葛根素注射液体外溶血实验取玻璃试管10支，编号，按照表1所示加样，其中1～8号管为样品管，9号为阴性对照管，10号为阳性对照管。

各管依次加入葛根素注射液、0.9%生理盐水或蒸馏水，最后加入5%红细胞悬液，试管内葛根素终浓度为0.4、0.8、2、4、6、8、10、12 g·L-1。

各试管摇
匀后于37 ℃孵育3、6 h，孵育结束后1 500 r·min-1离心15 min，于545 nm 处，1 cm光径测吸光度，并按照以下公式计算溶血率：溶血率(%)=(OD待测-OD阴性)/(OD阳性-OD阴性)×100%。

2.1 低剂量葛根素注射液给药后家兔体外溶血规律
2.1.1 正常家兔低剂量葛根素注射液给药后体外溶血规律正常家兔红细胞与不同浓度葛根素注射液体外孵育后溶血率结果显示，在葛根素终浓度为0.4～4 g·L-1的范围内，随着葛根素浓度升高溶血率逐渐增大；而在葛根素终浓度为4～12 g·L-1范围内，随着葛根素浓度升高溶血率有所下降。

在给药周期中，随着给药时间的延长，各浓度点的溶血率较之未给药组均有所升高，在给药第6天溶血率达到最大值。

体外孵育3 h时，给药6 d的溶血率在葛根素终浓度为0.4、0.8、6、8、10、12 g·L-1的溶血率与未给药及给药4 d相比差异有统计学意义。

体外孵育6 h，给药6 d时红细胞的体外溶血率高于其他天数给药组，与未给药组在葛根素终浓度为2、6、8、10、12 g·L-1差异有统计学意义。

可见在给药6 d时，溶血率较之其他时间有明显增高,见表2，3。

2.1.2 糖尿病家兔低剂量葛根素注射液给药后体外溶血规律糖尿病组家兔红细胞与不同浓度葛根素注射液体外孵育后溶血率结果显示，在葛根素终浓度为0.4～4 g·L-1范围，溶血率逐渐升高；在葛根素终浓度为4～12 g·L-1范围内，溶血率先下降后略升高。

低剂量葛根素注射液给药后，糖尿病家兔红细胞体外溶血率在各个时间点及浓度点较正常家兔有所升高，但大部分差异无统计学意义，在给药第4天时，各浓度点的溶血率较其他天数有所增大，在给药4 d后溶血率较之前略降低。

孵育6 h的溶血率高于孵育3 h，溶血率随给药时间延长而升高，第4天达到最大值，之后逐渐降低。

体外孵育6 h的溶血曲线与3 h相比略有不同，在给药第6天和第8天时，葛根素终浓度为8 g·L-1的溶血率略升高。

见表4，5。

2.2 中剂量葛根素注射液给药后家兔体外溶血规律
2.2.1 正常家兔中剂量葛根素注射液给药后体外溶血规律中剂量葛根素注射液给药后，正常家兔红细胞与不同浓度葛根素体外孵育后，溶血率高于低剂量组给药的溶血率。

随着给药天数的延长，红细胞体外孵育3 h的溶血率逐渐升高，在给药第8天时达到最大值，而后略有下降。

孵育6 h的溶血率在第2天和第4天时有所增高，后逐渐下降，但仍高于未给药组。

在孵育6 h时，第4天和第6天溶血曲线的最高点出现在2 g·L-1的葛根素终浓度点上，曲线的走势略有不同。

见表6,7。

2.2.2 糖尿病家兔中剂量葛根素注射液给药后体外溶血规律糖尿病家兔红细胞体外溶血率在葛根素终浓度为0.4～4 g·L-1范围内随浓度升高而增大；而在4～12 g·L-1浓度范围内，溶血率先逐渐降低而后又略微升高。

在中剂量葛根素注射液给药后，糖尿病家兔红细胞体外孵育3 h溶血率随时间延长而逐渐升高，给药6 d后达到最大值，之后略微下降，但仍高于给药前。

体外孵育6 h溶血率高于孵育3 h组，且随给药时间延长溶血率升高，在第6天达到最大值，之后略微下降。

见表8,9。

2.3 高剂量葛根素注射液给药后家兔体外溶血规律
2.3.1 正常家兔高剂量葛根素注射液给药后体外溶血规律正常家兔红细胞与不同浓度葛根素注射液体外孵育3 h，在葛根素终浓度为0.4～4 g·L-1范围内，随葛根素浓度升高溶血率逐渐增大；而在葛根素终浓度为4～12 g·L-1范围内，溶血率随浓度升高而降低。

体外孵育6 h，溶血曲线与3 h相比略有不同，在葛根素终浓度为0.4～2 g·L-1范围内，溶血率随葛根素浓度升高而增大；而在葛根素终浓度为2～12 g·L-1范围内，溶血率随浓度升高而降低。

高剂量葛根素注射液给药1周期后，体外孵育3 h各浓度点溶血率随着给药天数延长而升高，在第6天达到最大值，随后略有下降。

体外孵育6 h的溶血率较之孵育3 h有明显升高，给药后溶血率随给药天数延长而升高，同样在第6天达到最大值，随后有所降低。

低浓
度范围内，体外孵育6 h各时间点的溶血率与未给药时相比差异有统计学意义。

见表10,11。

2.3.2 糖尿病家兔高剂量葛根素注射液给药后体外溶血规律糖尿病家兔红细胞体外溶血率整体高于正常家兔红细胞。

在高剂量葛根素注射液第1给药周期，家兔红细胞体外孵育3 h各浓度点的溶血率随给药时间的延长而升高，给药第8天达到最大值，之后略有降低。

糖尿病家兔红细胞体外孵育6 h，溶血率在葛根素终浓度为4 g·L-1达到最大值，各浓度点的溶血率同样随给药时间的延长而增加，在第6天时达到最大值，之后略有降低。

给药早期，高浓度葛根素(6～12 g·L-1)的溶血率较之正常高剂量组差异有统计学意义。

见表12,13。

家兔静脉注射给予葛根素注射液后，会在一定程度上引起红细胞的损伤，主要表现为家兔红细胞体外溶血实验中溶血率的增大，以及红细胞形态的变化(出现皱缩、破裂、大小不均一)。

不同剂量葛根素注射液都会引起家兔红细胞体外溶血率的增大，且增大的趋势与剂量成正相关性。

同时，溶血率的变化与给药天数相关，在给药6～8 d后，溶血率出现峰值，随后缓慢恢复。

有研究结果表明，葛根素注射液体内给药后，会导致免疫性溶血的发生，在连续给药的过程中，体内的抗体逐渐累积，在给药第8天时呈现最大值。

葛根素作为小分子的半抗原，在进入体内后与体内的大分子结合形成抗原，进而结合在红细胞表面上，形成免疫复合物，改变红细胞的表面结构，致使红细胞更易发生破裂。

糖尿病家兔红细胞体外溶血率较之正常家兔有所升高，在葛根素注射液给药后溶血率的变化趋势与正常家兔类似。

由于糖尿病家兔的红细胞在体内高糖环境下变形指数下降，红细胞的刚性指数上升，血液流变学指标增大，红细胞膜上膜蛋白表达改变，脂质过氧化，胆固醇/磷脂比例的改变，同时还伴随有Na+/K+-ATPase的活性改变[11-12]，这些因素都影响着红细胞的结构功能。

因此，糖尿病家兔的红细
胞较之正常家兔红细胞对于药物作用更加敏感，直接表现为体外溶血率的升高。

同时，葛根素在糖尿病家兔体内的药代动力学较之正常家兔有显著的变化，药物清除速率降低，在体内蓄积的药物浓度增大，体内红细胞处在一个相对较高的葛根素浓度中，葛根素对其的作用更加显著，红细胞的损伤叠加，体外溶血率升高。

由于临床用药中患者处于病理状态，红细胞的各项功能都有所改变，采用糖尿病模型动物红细胞研究葛根素注射液的体外溶血作用更加符合临床实际。

实验结果表明，在糖尿病状态下，红细胞的体外溶血率较之正常状态有显著升高，但整体的溶血率变化趋势与正常家兔相同。

在糖尿病状态下，红细胞的刚性指数、变形能力以及红细胞脆性等指标较之正常状态有了显著的变化，导致红细胞在药物作用下更容易破裂，导致溶血反应。

综上所述，在临床用药过程中，要注意在给药6～8 d后患者的基本状况，若出现肌肉酸痛、腰痛、尿潜血等状况时，应考虑葛根素导致溶血的可能。

同时应注意药物的用量，在药品说明书规定范围内合理用药。

若需长时间用药，要分周期给药，每个给药周期间间隔4～5 d作为清洗期，避免长时间连续用药导致药物不良反应发生。