胸腺肽α1的温度诱导原核可溶性表达与简易纯化

胸腺肽α1的温度诱导原核可溶性表达与简易纯化
陈培富;李红芳;鲁琼芬;陈俊
【摘要】An artificially synthesized gene of human thymosin a, (Tα1) was inserted into pBV222 and then thermo-inductively expressed as a fusion protein in a soluble form in transformed Escherichia coli strain DH5α at 42°C. The fusion protein purified through nickel affinity chromatography was cleaved with enterokinase. The cleavage mixture was returned to the nickel affinity chromatography column. Recombinant Tα1 (rTα1) in the flow-through reached a purity of 94. 5% as showed by sodium dode-cyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ( SDS-PAGE ) and 72% by reverse phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC), respectively. The finally purified rTα1, exhibited the same bioactivity as chemically synthesized Tα1, in rosette tests with peripheral blood lymphocytes from cancer patients.%将人工合成的人胸腺肽α1(Tα1)基因插入到载体pBV222,转化大肠杆菌DH5α菌株并置42℃诱导表达可溶性融合蛋白.融合蛋白经镍亲和层析柱纯化,加入肠激酶切割,再将酶切反应体系回到镍亲和层析柱.所获穿过液中的重组胸腺肽α1(rTα1),经十二烷基硫酸钠-聚苯烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离及分析,纯度分别为94.5％和72％.以癌症患者外周血淋巴细胞开展玫瑰花环试验,所获rTα1纯品显示出与化学合成Tα1(sTα1)相同的生物学活性.
【期刊名称】《云南农业大学学报》
【年(卷),期】2012(027)002
【总页数】5页(P183-187)
【关键词】胸腺肽α1;原核表达系统;镍亲和层析;反相高效液相色谱;玫瑰花环试验【作者】陈培富;李红芳;鲁琼芬;陈俊
【作者单位】云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明650201;云南农业大学动
物科学技术学院,云南昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明650201
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
胸腺肽α1(thymosin α1，Tα1)是由胸腺上皮细胞分泌的、具有免疫调节活性的
28肽，其结构在人与哺乳动物 (如牛、大鼠和小鼠)完全一致。

Tα1被视为T细胞佐剂，因它能刺激T细胞增殖、发育成熟及表达CD2，拮抗类固醇引起的T细胞
凋亡，上调巨噬细胞与树突状细胞等抗原提呈细胞MHCⅠ类分子及细胞因子的表达，最终加强细胞免疫应答［1－4］。

Tα1具有抑制病毒复制和肿瘤生长的作用，临床上已用于治疗严重威胁中国公众健康的慢性乙型肝炎或丙型肝炎［5－7］，
并已用于治疗非小细胞肺癌等癌症以及因肿瘤病、放疗、化疗或免疫老化引起的免疫抑制［8－9］。

这种多肽还被批准用作流感疫苗与乙肝疫苗的佐剂［10］。

Tα1最初提取自小牛胸腺。

目前药用的Tα1主要由人工化学合成，需要在每一步
反应后除掉不正确的连接产物，导致原材料浪费和生产成本较高。

与化学合成或从动物组织提取相比，原核表达系统凭借其高效表达外源基因的优势，将来有可能用于大批量生产重组Tα1(rTα1)，以满足巨大的市场需求。

虽然通过细菌或酵母菌成功表达 Tα1已经报道多年［11－18］，但rTα1的纯化问题还没有彻底解决。

本
文作者曾构建过几个Tα1表达载体［19］，随后研究发现联合应用镍亲和层析和
反相高效液相色谱 (RP-HPLC)，可很简便地从温度诱导大肠杆菌 (E.coli)表达产物中获得高纯度的可溶性活性胸腺肽，现报告如下。

1 材料与方法
1.1 Tα1表达载体的构建及克隆
依据载体pBV222(中国科学院病毒研究所馈赠)多克隆位点和人Tα1cDNA(基因数据库序列号M14794)的序列，采用大肠杆菌偏爱的密码子，设计两端分别带有EcoRⅠ与SalⅠ酶切位点、中间部分有25 bp互补的1对特异核酸引物，送交上
海捷倍思公司合成。

Tα1全长编码序列为TCT GAT GCA GCG GTG GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACT AAA GAT CTG AAA GAA AAG AAA GAA GTT GTG GAA GAG GCG GAA AAC TAA。

肠激酶识别序列 (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)添加在Tα1第1个氨基酸残基之前。

以上述引物互为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。

编码Tα1的质粒按常规双酶切定向克隆方法构建，然后经热刺激转化感受态大肠杆菌细胞(DH5α菌株)，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培
养基，置37℃培养20 h，挑选数个单菌落置3 mL LB液体培养基内扩增，取部
分细菌悬液加入50%灭菌甘油混匀后置－20℃冻存，剩余细菌悬液用于提取质粒，经过DNA测序 (上海生工有限公司)鉴定阳性细菌克隆。

1.2 融合蛋白的诱导表达、纯化及酶切
将阳性细菌克隆缓慢振荡培养过夜使其活化，按0.5%(V/V)比例加入到1 L含氨苄青霉素的LB液体培养基，置35℃振荡培养至OD600为0.5，然后升至42℃以250 r/min诱导表达 6 h或180 r/min诱导表达过夜。

细菌沉淀用pH 8.0的结合缓冲液 (0.5 mol/L NaCl+ 50 mmol/L Na3PO4)悬浮，快速冻融2次，冰浴条件下用超声波破碎细菌，直至显微镜下检查菌体已经充分片断化。

16 000 r/min离
心15 min收集细菌裂解物溶液上清液，经80℃热处理30 min，再次离心，所获
上清液用于螯合有镍离子的树脂柱子(Invitrogen，USA)，以结合缓冲液淋洗至流出液OD280低于 0.005(Beckman Coulter，USA)，再以含10 mmol/L咪唑的
相同缓冲液淋洗至OD280低于0.01，最后以250 mmol/L咪唑溶液洗脱、收集
融合蛋白。

洗脱产物置4℃对100倍体积的生理盐水透析2遍，然后经十二烷基
硫酸钠－聚苯烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分析或以Lowry法测定蛋白含量。

按0.5 mg融合蛋白与1 u肠激酶(杭州华东医药有限公司)的比例置28℃酶切12 h，转入80℃处理30 min以灭活肠激酶。

将酶切混合物缓慢通过已经结合缓冲液平
衡完毕的镍柱，收集穿过液，冷冻保存。

依据需要，用超滤法 (截留相对分子质量
3 000 u)或PEG-20000脱水法浓缩回收产物。

1.3 蛋白质分析
采用5%积层胶和18%分离胶，以SDSPAGE分析细菌裂解物溶液、裂解物溶液
上清、镍柱穿过液和洗脱产物。

电泳完毕后，凝胶用0.25%考马斯亮蓝R-250染色，目的蛋白条带的相对含量由ImageMaster VDS(Pharmacia Biotech，Sweden)灰度扫描分析得出。

纯化的融合蛋白和rTα1用分光光度计 (Beckman Coulter)和Lowry法定量。

由镍柱初步纯化得到的rTα1经反相高效液相色谱(RP-HPLC)(Water's，model 2695，USA)分离与分析，对应主峰面积的收集物再次用RP-HPLC确认纯度。

1.4 玫瑰花环试验
参照文献［20］进行，略有改动。

将由RPHPLC纯化得到的rTα1置4℃对100
倍体积的DHanks溶液 (pH 7.2)透析3遍，再以PRIM1640细胞培养液调整至150 μg/mL(中国国家药检局推荐方案)。

外周血淋巴细胞来自某省级医院5位癌症志愿者的抗凝外周血混合样，用淋巴细胞分离液水平离心分离，置45℃温浴15 min以使其失去已有的绵羊红细胞 (SRBC)受体。

取淋巴细胞(3.0×106个/mL)与等体积rTα1溶液充分混合，37℃温浴60 min，加入10倍数量的 SRBCs(云南省
种羊场提供)。

同时设D-Hanks溶液 (pH 7.2)添加组为空白对照，人工化学合成
的N端乙酰化Tα1(成都地奥制药公司)为阳性对照。

以上每组设2个重复。

4℃放置过夜，在显微镜下计数200个淋巴细胞，记录结合有3个或3个以上SRBCs的淋巴细胞数量，计算平均值，并除以40%来表示外周血T淋巴细胞的玫瑰花环形
成率。

当Tα1处理组的玫瑰花环形成率超过空白对照组10%以上，可判定为活性合格。

2 结果与分析
2.1 融合蛋白的表达与纯化
凝胶图像扫描分析显示，DH5α/pBV222表达系统产生相对分子质量为4.9 ku的融合蛋白，在细菌总蛋白中的相对含量为12.6%(图1)。

热处理(80℃/30 min)使
细菌裂解物溶液上清液中的众多杂蛋白去除，但不会使上清液中的融合蛋白受到损失。

约100 mg融合蛋白可被1.5 mL树脂完全结合。

SDS-PAGE分析发现，经过镍柱亲和层析，融合蛋白的相对含量为95%。

2.2 rTα1的回收
SDS-PAGE分析显示，rTα1占总的柱穿过蛋白的94.5%(图1泳道6)。

有趣的是，相对分子质量约为28 ku的1个杂蛋白以及未被切开的融合蛋白和切开后产生的His标签部分出现在再次镍柱亲和层析的洗脱产物中 (图1泳道7)。

镍柱亲和层析得到的rTα1粗制品，经RP-HPLC分析，纯度为72%，停留时间为13.456
min(图2)，而sTα1停留时间为13.633 min(未显示资料)。

经RP-HPLC分离对
应主峰获得的精制rTα1纯度已达到99%以上 (未显示资料)。

从1 L细菌培养物所获rTα1粗制品与精制品的产量分别为2.9 mg和2.1 mg。

2.3 生物学活性测定
空白对照玫瑰花环形成率为13%，rTα1处理组为34%，而且单个淋巴细胞结合
的SRBCs数量明显增加 (图3)，阳性对照即sTα1处理组为36%(未显示资料)。

3 讨论
载体pBV222专门设计用于温度诱导表达由PRPL启动子指导的N端携带His×6
标签的外源蛋白，而不需要使用昂贵的异丙基－β－D－硫代半乳糖苷 (IPTG)为诱导剂。

本试验发现42℃恒温振荡培养有必要维持较长时间，因为融合蛋白的表达
水平取决于诱导时间的长短，可至20%之间变化 (未显示资料)。

本试验
DH5α/pBV222表达系统的融合蛋白表达水平为12.6%(图1)。

本试验发现，以1 g细菌沉淀、10 mL结合缓冲液和0.5 mL树脂的比例纯化融合蛋白是可行的。

细菌裂解物溶液上清液经过热处理，杂蛋白的含量明显减少，但未出现融合蛋白的损失 (图1)，这与已知Tα1的热耐受性和高溶解度一致。

不同于
其他多数蛋白的原核高表达，本研究未发现包涵体在细菌细胞内形成，使纯化融合蛋白非常简便。

低浓度咪唑洗涤有助于去除非特异性结合在树脂微粒上的无关蛋白。

镍柱纯化得到的rTα1可达到72%的HPLC纯度 (图2)，提示从酶切反应混合物中意外除掉28 ku细菌蛋白的贡献，以及该蛋白可能含有线性或立体的组氨酸结构域。

DH5α/pBV222表达系统的rTα1产量为细菌沉淀湿重的0.14%，这个数值是从
小牛胸腺组织提取产量 (约为匀浆0.008%)的18倍［20］。

若不考虑未被酶切的融合蛋白量，rTα1的损失主要与肠激酶的纯度不够有关，因为发现本试验所用的
肠激酶可能被胰蛋白酶等其他酶污染，以致能降解sTα1(未显示资料)。

如果改善
发酵条件和优化酶切条件，如使用高纯度肠激酶或胰蛋白酶抑制剂，rTα1的收获
率应有提高的较大空间。

rTα1缺乏 N-乙酰化［21－22］，可解释其与sTα1在
停留时间的轻微差异。

本试验未采用噻唑蓝(MTT)比色法测定Tα1诱导的淋巴细
胞增殖反应，而是采用简便的玫瑰花环试验，结果显示rTα1具有类似sTα1促进SRBC受体即CD2表达的活性，表明N-乙酰化并非Tα1发挥活性所必需。

总体看来，DH5α/pBV222表达系统以其简单的诱导表达方式、经镍柱简便除掉各种杂蛋白和较高的rTα1收获率，可考虑用于大规模发酵制备rTα1。

［参考文献］
［1］ROMANI L，BISTONI F，MONTAGNOLI C，et al.Thymosin alpha1:an endogenous regulator of inflammation，immunity，and tolerance ［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，2007，1112(1):326 －338.
［2］YAO Q Z，DOAN L X，ZHANG R X，et al.Thymosinalpha1 modulates dendritic cell differentiation and func-tional maturation from human peripheral blood CD14+monocytes［J］.Immunology Letters，2007，110(2):110－120.
［3］NAYLOR P H，QUADRINI K，GARACI E，et al.Immunopharmacology of thymosin alpha1 and cytokine synergy［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，2007，1112(1):235－244.
［4］LI J，LIU C H，WANG F S.Thymosin alpha 1:biological activities，applications and genetic engineering production［J］.Peptides，2010，31(11):2151 －2158.
［5］CHEN P F，FU G F，ZHANG H Y，et al.Liposomal plasmid DNA encoding human thymosin alpha and interferon omega potently inhibits liver tumor growth in ICR mice［J］.Journal of Gastroenterology and Hepatology，2006，21(10):1538－1543.
［6］JIANG Y F，MA Z H，ZHAO P W，et al.Effect of thymosin-α(1)on T-
helper 1 cell and T-helper 2 cell cytokine synthesis in patients with hepatitis B virus e antigenpositive chronic hepatitis B［J］.The Journal of International Medical Research，2010，38(6):2053－2062.
［7］SHERMAN K E.Thymosin alpha 1 for treatment of hepatitis C
virus:promise and proof［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，2010，1194(1):136－140.
［8］GARACI E，PICA F，SINIBALDI－VALLEBONA P，et al.Thymosin
alpha(1)in combination with cytokines and chemotherapy for the treatment of cancer［J］.International Immunopharmacology，2003，
3(8):1145－1150.
［9］NAYLOR P H，HADDEN J W.Preclinical studies with IRX-2 and thymosin alpha1 in combination therapy［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，2010，1194(1):162－168.
［10］GOLDSTEIN A L.From lab to bedside:emerging clinical applications
of thymosin alpha 1［J］.Expert Opinion on Biological Therapy，2009，
9(5):593－608.
［11］石继红，张英起，赵永同，等.胸腺素α1基因的克隆表达及其生物活性［J］.中国生物化学与分子生物学报，2001，17(3):344－349.
［12］章军，秦燕，欧阳青，等.蓝藻Synechococcus sp.PCC7942穿梭表达质
粒的构建及胸腺素α1基因的表达［J］.实验生物学报，2003，36(1):1－4. ［13］苗红，郭葆玉，张冉，等.重组胸腺素α1的表达，纯化和生物学活性［J］.中国生物化学与分子生物学报，2003，19(5):636－639.
［14］CHEN F，CHEN X M，CHEN Z，et al.Construction and application of a yeast expression system for thymosin alpha1［J］.Biology of the Cell，
2005，29(3):253 －259.
［15］金明飞，徐伟东，黄静，等.基因串联原核高效表达胸腺肽α1［J］.中国生物工程杂志，2007，27(1):11－15.
［16］CHEN Y，ZHAO L，SHEN G，et al.Expression and analysis of thymosin alpha1 concatemer in Escherichia coli［J］.Biotechnology and Applied Biochemistry，2008，49(Pt 1):51－56.
［17］ZHOU L，LAI Z T，LU M K，et al.Expression and hydroxylamine cleavage of thymosin alpha 1 concatemer［J］.Journal of Biomedicine and Biotechnology，2008，2008:736060.
［18］LI W，SONG L，WU S，et al.Expression，purification and characterization of a novel soluble human thymosin alpha1 concatemer exhibited a stronger stimulation on mice lymphocytes proliferation and higher anti-tumor activity［J］.International Journal of Biological Sciences，2011，7(5):618－628.
［19］CHEN P F，ZHANG H Y，FU G F，et al.Overexpression of soluble human thymosin alpha 1 in Escherichia coli［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2005，37(2):147－151.
［20］BAUMANN C A，BADAMCHIAN M，GOLDSTEIN A L.Thymosin alpha 1 antagonizes dexamethasone and CD3-induced apoptosis of CD4+ CD8+ thymocytes through the activation of camp and protein kinase C dependent second messenger pathways［J］.Mechanisms of Ageing and Development，1997，94(1/2/3):85－101.
［21］FANG H Q，ZHANG X，SHEN L，et al.RIMJ is responsible for
N(alpha)-acetylation of thymosin alpha1 in Escherichia coli［J］.Applied
Microbiology and Biotechnology，2009，84(1):99－104.
［22］ESIPOV R S，STEPANENKO V N，BEYRAKHOVA K A，et
al.Production of thymosin alpha1 via non-enzymatic acetylation of the recombinant precursor［J］.Biotechnology and Applied Biochemistry，2010，56(1):17－25.。